酶标记方法介绍

交联法通常用的交联剂是戊二醛，戊二醛商品大多为25%的水溶液，利用戊二醛分子上对称的两个醛基，分别与酶和蛋白质分子中游离的氨基、酚基等以共价键结合而进行标记。标记时应尽量采用新鲜纯品，当戌二醛的OD ₂₃₅ nm/OD ₂₈₀ nm＜3时，即为好的交联剂。

戊二醛交联法又分为一步法和二步法。

⑴ 一步法：即把酶、戊二醛和抗体一起加入进行交联。然后透析出过量的戊二醛而制备出具有高分子量的酶结合物。由于抗体分子量大(16万)，酶分子量小(4万),抗体分子的氨基数比酶蛋白分子氨基数多得多，结果生成的抗体－戊二醛或抗体－戊二醛－抗体多而造成酶标物的活性小。一步法操作：①抗IgG－AKP的制备：将10mgAKP溶于含有5mg抗IgG的1mlPBS(0.01Mol/L pH7.0)中，在冰浴中缓缓搅拌，尽量避免气泡产生，完全溶解后，缓缓滴加1%戊二醛溶液4ml，使戊二醛的最终浓度为0.2%，移至室温中静置2h~3h后，以0.01Mol/L pH7.0 PBS液 4℃ 充分透析或以SephadexG25柱除去过量的戊二醛， 4℃ 保存备用(也可保存于50%甘油中置低温冰箱)；②抗IgG－HRP的制备：将12mgHRP溶于含5mg抗IgG的1mlPBS(0.1Mol/L pH6.8)中,缓慢搅拌下加入1%戊二醛溶液4mL，置室温2h~3h，充分透析或以SephadexG ₂₅ 除戊二醛，小量分装后保存于低温冰箱，避免反复冻融。或冷冻干燥保存。

⑵ 二步法：是先使酶与戊二醛反应,除去未反应的戊二醛，再使已“活化”的酶分子与抗体分子的氨基结合，最后加入少量的赖氨酸封闭被戊二醛激活的酶的残基。二步法操作：将10mg的酶溶于0.2ml含1.25%戊二醛的0.1mol/L pH6.8 PBS中室温放置18h，充分透析或以SephadexG ₂₅ 柱除去未反应的戊二醛。加生理盐水至1ml然后加入1ml(含5mg)的抗体溶液和1ml 1Mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液，混合后 4℃ 冰箱放置24h，加入0.1ml 0.2mol/L赖氨酸，置室温2h，以0.15Mol/L pH7.2 PBS液充分透析，离心去沉淀，上清液即为酶结合物，再进一步以硫酸铵沉淀纯化后应用。AKP一般不采用二步法,而只用一步法。

改良HRP二步标记法：取HRP10mg溶于0.4ml,0.25Mol/L pH6.8PBS液中或0.05Mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液中，加入25%戊二醛0.1ml， 37℃ 温育2h后加入冰冷的分析纯的无水乙醇2ml，2 500r/min离心沉淀10min~15min，倾去溶液。沉淀以80%乙醇4ml~5ml混悬，同上离心，倾去乙醇，将管倒置，使乙醇充分流出。沉淀用1ml 0.05Mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液溶解，加入0.5ml~1ml 抗IgG抗体溶液(含抗体15mg左右)，放在冰箱内过夜后，加KH ₂ PO ₄ ，使近中性即可应用。

 

 

氧化法 

采用过碘酸钠，过碘酸钠是强氧化剂，能将HRP的甘露糖部分(与酶活性无关的部分)的羟基氧化成醛基，然后与抗体的氨基结合,形成酶标抗体。

（1）氧化法操作过程如下：将5mgHRP溶于新配制的1ml 0.30Mol/LpH8.1重碳酸钠中，加0.1 ml 1%氟二硝基苯(FDNB)无水乙醇溶液,在室温中混合后，再加入1ml 0.04Mol/L~0.08Mol/L过碘酸钠(NaIO ₄ )，置室温中轻搅30min，在溶液呈黄绿色时，加1ml 0.16Mol/L乙二醇溶液，在室温中放置1h，使氧化反应中止，然后在 4℃ 中对0.10Mol/L pH 9.5重碳酸钠缓冲液透析，换液3次。在3ml HRP－醛基溶液中，加入5mg(溶于1ml的碳酸盐缓冲液中)，室温置2h~3h，加入5mg氢化硼钠(NaBH ₄ )，于 4℃ 冰箱放置3h或过夜，然后用PBS液充分透析，离心去沉淀物。上清液即为酶结合物，纯化后使用。

（2）改良过碘酸钠法：①取5mg HRP溶于0.5ml双馏水中，加入新配制的0.06Mol/L NaIO ₄ 水溶液(10ml双馏水＋128mg NaIO ₄ ) 0.5ml，混匀，置 4℃ 30min；② 取出后加入0.16Mol/L乙二醇水溶液(10mlH ₂ O 0.09ml乙二醇)0.5ml，室温放置30min；③加入含5mg纯化抗体的水溶液1ml，混匀，并装入透析袋，对0.05Mol/L pH 9.5碳酸盐缓冲液缓缓搅拌透析6h(或过夜)，使之结合；④加入NaBH ₄ 溶液(5mg/ml)0.2ml，混匀，置 4℃ 2h；⑤在以上溶液中缓慢加入等体积的饱和硫酸铵溶液，混匀， 4℃ 30min，离心，去上清，沉淀以少许0.02Mol/L pH7.4 PBS液溶解，装入透析袋，以同样液体在 4℃ 透析除盐过夜；⑥次日取出离心，以除去不溶物，即得酶－抗体(HRP－IgG)结合物，以0.02Mol/L pH 7.4 PBS液加至5ml；⑦效价测定合格后，加入等量优质甘油，分装小瓶，低温保存。

戊二醛法与过碘酸钠法比较

比较项目	戊二醛法	过碘酸钠法
一步法	二步法
标记方法	简单	较复杂	较复杂
酶利用率	2～4%	2～4%	70%酶偶联到99%抗体上
产率	＜5%	＜5%	＞50%
标记抗体分子量	750万	＜25万	＞40万
穿入组织能力	差	好	一般
抗体活性丢失	多	少	较多
酶活性丢失	多	少	较多
染色效应	差	较好	较好

 

 

二马来酰亚胺法 

二马来酰亚胺(Dimaleimide)能与蛋白质半胱氨酸的硫基反应。首先用α－巯基乙胺还原蛋白质(IgG),并用N、N ^‘ －Ｏ－苯二马来酰亚胺活化，然后除去多余的 试剂 ，最后使含二马来酰IgG与含硫基的β－半乳糖苷酶连接。具体操作如下：将抗lgG 抗体 溶于0.1Mol/L pH5.0醋酸钠 缓冲液 并对同一 缓冲液 透析平衡过夜,离心除去不溶性物质,抗IgG(14mg/2ml)与10mlα－巯基乙胺在 37℃ 温育90min。过Sephadex后浓缩使每ml含3.0mg左右的还原抗IgG。在 0℃ 中,按1︰1滴加饱和N _、 、N ^‘ －O－苯二马来酰亚胺溶液，混合，于 30℃ 温育20min，过SephadexG ₂₅ 柱，除去未反应的二马来酰亚胺。收集二马来酰亚胺“活化”的抗IgG,浓缩使浓度为OD _280nm =1.0(光径 1cm ),取1ml溶液加20μl(5mg/ml)β－半乳糖苷酶，置 30℃ 20min，用0.10Mol/L NaOH中和后，于 4℃ 置24h~72h，再过Sepharose-6B柱(1.5× 40cm )，以pH7.0PBS洗脱,收集酶结合物，加叠氮钠(NaN ₃ )防腐， 4℃ 保存备用。