单克隆抗体技术：抗体检测

互联网2013-11-14

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用检测抗体的方法从杂交细胞中筛选出生产指定抗体的杂交株是很重要的。检测抗体的方法很多，从沉淀反应到放射免疫测定。由于细胞培养液中的抗体浓度通常是很低的，而且传统的检测方法多是以多价抗原与多克隆抗血清相反应。杂交瘤产生的抗体则是单克隆的，所以并不是每项方法都能适用。一定要选择敏感的、快速的、一次又能检测多份样品的方法。常用的检测方法如下：

１．试管溶血反应检测法

（ 1 ）材料：①杂交瘤细胞，换液后至少两天才收取培养液；②绵羊红血球，洗涤三次后，配成 1 ％悬液；③豚鼠补体，无菌采取补体，以 pH7.2PBS 稀释成 20 ％溶液，分装小瓶，于﹣ <chmetcnv>40 ℃ </chmetcnv> 保存。使用时以补体和压积红血球 5 : 1 （ V/V ）的量进行吸收， <chmetcnv>4 ℃ </chmetcnv> 30min ，然后 2 000r/min 离心 10min ，去红血球，取上清液备用； ④ 0.01Mol/L pH7.2PBS 液。

（ 2 ）操作方法： ① 在小试管中，加入 0.1ml 杂交瘤细胞用过的培养液，再加入 0.1ml pH7.2 的 PBS 液，然后倍比稀释至一定的稀释度； ② 加入 0.1ml 补体和 1 ％绵羊红血球 0.1ml ，混匀后置 <chmetcnv>37 ℃ </chmetcnv> 水浴 1h ； ③ 观察结果，以绵羊红血球完全溶解的杂交瘤细胞培养液的最高稀释倍数为抗体的溶血效价。

2 ．斑点检测法 抗红血球表面的单克隆抗体与浇灌在琼脂板的红血球结合，进而结合补体，而发生溶血斑点，对着光源用肉眼即可判定。

（ 1 ）材料：①绵羊红血球，处理同试管法，最后配成 25 ％红血球悬液； ② 新鲜豚鼠血清（同试管法处理）； ③ 琼脂糖，配成 0.6 ％ PBS 液，水浴中溶化； ④ 0.01Mol/L pH7.2PBS 液； ⑤ 兔抗羊红血球抗体。

（ 2 ）操作方法： ① 将溶化的 0.6 ％琼脂糖倒入一试管中，置 45 ℃～ <chmetcnv>48 ℃ </chmetcnv> 水浴中； ② 加 0.1ml 25 ％红血球悬液， 0.1ml 豚鼠补体，迅速混匀，倾注一干净载玻片上； ③ 凝固后，在凝胶表面固定区域滴加 2ml 待测样品，标准阳性血清和对照试液； ④ 待溶液全部渗入凝胶后，置湿盘； ⑤ <chmetcnv>37 ℃ </chmetcnv> 温育 1h ～ 2h ，观察并判定结果。

强阳性（ ） 中等阳性（ ）

弱阳性（ ） 阴性（﹣）

必要时可置室温过夜，再判定一次。

3 ．膜荧光检测法

（ 1 ）材料： ① 培养液 HEM 或 RPMI － 1640 ； ② 荧光试剂：异硫氰酸荧光素（ FITC ）标记的抗小鼠免疫球蛋白； ③ 50 ％甘油缓冲液： 1 份甘油加 1 份体积 0.05Mol/L pH 7.2 PBS 液混合即成； ④ 荧光显微镜、载玻片、盖玻片、吸管等。

（ 2 ）操作方法：①用培养液洗涤二次细胞，悬浮成 2.0 × 107 ／ ml ； ② 50 µ l 细胞悬液加 50 μ l 培养上清液混合，置 <chmetcnv>4 ℃ </chmetcnv> 30min ，用培养液洗涤 3 次， 1 000r/min 离心； ③ 以 50 µ lFITC —抗小鼠免疫球蛋白重新悬浮压积细胞，水浴 30min ～ 60min ； ④ 用冷培养液洗 3 次细胞，重新悬浮； ⑤ 取一滴细胞悬液滴在玻片上，复盖片，用甘油缓冲液封固，置荧光显微镜下观察。着色细胞也可以在固定后观察，一滴细胞悬液，涂片、风干，用 95 ％酒精固定 10min ，固定后的载玻片用 PBS 洗涤，盖上盖玻片，进行观察。

4 ．免疫球蛋白和亚类球蛋白的检测 以琼脂双扩散试验法进行，此法简单易操作，特异性好。注意必须将培养液浓缩 10 ～ 50 倍，否则做双向琼扩不出现沉淀线。其检测方法为：

（ 1 ）制备各种兔抗小鼠 IgG1~4 、 IgM1~2 、 IgA1~2 和 K 、 λ 抗血清 , 也可直接购买。

（ 2 ）取 5ml 培养物的上清液缓慢加入 0.5ml 的饱和硫酸铵溶液，混匀，静置 3h ，离心沉淀，去上清，沉淀加 0.05ml 蒸馏水溶解。

（ 3 ）制成 1 ％琼脂糖凝胶板，打孔。中间孔加 20 μ l 浓缩上清液，周围孔加 20 µ l 特异性抗血清，以 10 μ l 正常小鼠血清作对照。

也可以采用酶联免疫吸附试验、间接血凝试验以及放射免疫等方法检测。