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单克隆抗体技术

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1975年,Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合,形成的杂交细胞既可产生抗体,又可无限增殖,从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元,也为临床疾病的诊断、预防和治疗提供了新的方法。
    1. 杂交瘤的基本原理 杂交瘤技术又称单克隆抗体技术(monoclonal antibody technique)。杂交瘤技术是使免疫动物的脾细胞在聚乙二醇(Polyethylene Glycol ,PEG)的诱导下与同系动物的骨髓瘤细胞融合。首先是细胞质融合,然后通过有丝分裂细胞核合而为一,形成新的杂交细胞,简称为杂交瘤。细胞融合后移入HAT培养液中培养。骨髓瘤细胞由于缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶(HGRPT),在HAT培养液中不能增殖而死亡。淋巴细胞培养中也不能长期在培养液中生长增殖。然而杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了HGPRT的基因产物,并从骨髓瘤细胞中获得肿瘤细胞不断生长繁殖(传代)的特性,因此在HAT培养液中选择性存活下来。细胞融合后既具有产生特异性抗体的能力。又保留了瘤细胞能体外长期培养的特性。
    2. 杂交瘤细胞制备
   (1)骨髓瘤细胞的培养:骨髓瘤细胞(NS-1或SP2/0)在含10~15的小牛血清完全培养液中培养处于对数生长期时,此时细胞浑圆、透亮,大小均一,排列整齐,呈半致密分布。选择处于旺盛生长,形态良好的对数生长期细胞供融合用。
   (2)免疫小鼠:选用8~12周龄雌性BALC/C小鼠免疫。如抗原为可溶性(蛋白质),可按每只鼠一次剂量为10~100μg/只免疫。蛋白质抗原与等量弗氏完全佐剂充分混匀,分别注入鼠的颈背部多处或腹腔内,间隔2~4周同法重复,经1月后,再用10~100μg(0.1~0.2ml)抗原作静脉或腹腔加强免疫。细胞与微生物表面抗原一般具有较高的免疫原性,可不加佐剂,直接经腹腔或静脉注入(1~2)×107细胞。一般采用融合前3~4d大剂量静脉注入抗原,然后取脾做融合实验。因此间脾脏B淋巴母细胞-浆细胞比例较高,融合率较高。
   (3)脾细胞制备:①放血处死小鼠,浸泡在75%的酒精中消毒。②在无菌条件下取脾,至含培养液的小平皿内,去掉脂肪和结缔组织,用5ml无血清培养液冲洗一次。③将脾细胞置细胞网上,加入5ml不完全培养液。用注射器内芯研磨分散脾细胞,将脾细胞收集到离心管内(50ml),加10~20ml培养液,离心(800~1000r/min,10min),弃上清后计数备用。
   (4)饲养细胞制备:在体外培养时,单个或少数分散的细胞不容易存活与繁殖,必须在加入其他活细胞才易存活与繁殖。通常在融合的前一天或当天用取小鼠腹腔巨噬细胞制作饲养层细胞。
    ①放血处死小鼠,浸泡在75%的酒精中消毒。②小心剪开腹部皮肤,用小镊子挑起腹膜,注入5ml无血清培养液,用镊子轻揉腹腔,将注入液体回抽,反复注入、抽吸2~3次。③将收集的细胞悬液注入50ml的离心管中,加20ml无血清培养液洗涤一次。④用含血清培养液(HAT)15~20ml调至4×105个细胞/ml,用吸管混匀后,接种到96孔板,每孔加0.1ml,置于37℃、5%CO2孵箱中。
   (5)细胞融合(杂交) :①分别吸取含107个骨髓瘤细胞和108个脾细胞悬液,加入50ml的离心管中,充分混匀,并加1640培养液至20ml,离心(1000 r/min,10min)。②弃上清,用手指轻击离心管底部,使沉淀混匀如糊状。然后置37℃水浴中。③取预热37℃的50% PEG 0.7ml,1min内在37℃水浴中边滴边摇动加入离心管中,使细胞保持在均匀状态。然后在37℃水浴中静置1.5min。④立即在2min内加37℃预温的RPMI 1640培养液15ml,以稀释PEG而失去的作用。开始要一滴一滴加,即可见细胞凝集成小块。操作宜轻柔,不损伤细胞,以免影响细胞融合。⑤以1000 r/min,离心7min,弃上清液,加25ml HAT培养液,轻轻混匀,滴加入含有巨噬细胞饲养液的96孔板中,每孔0.1ml。
    3. 杂交瘤细胞的选择性培养
   (1)培养:将融合后的细胞悬浮于HAT培养液中,置于含5%~7% CO2,37℃饱和湿度培养箱中培养。
   (2)换液:每2~3天更换一半量的培养液一次,在融合两周内使用HAT培养液,在第12~13天用HT培养液,在第14天后根据细胞增殖情况改用15%~20%FCS完全培养液。
在停用A后,残留于培养液或细胞内的A仍起一定的阻抑作用,此时需继续补加HT培养液,为杂交瘤细胞提供应急的DNA合成途径。
   (3)观察:经融合剂PEG处理后的细胞,凝集成粗颗粒状。当天用倒置显微镜观察,可见2~5个粘连骨髓瘤细胞,常有融合的巨细胞或哑铃状的细胞。一次融合成功的杂交瘤细胞生长情况大致如下:
第1~2天,各培养孔中肿瘤细胞锐减,残存的瘤细胞成黯黑或折光性差,在巨噬细胞周围聚有破碎细胞,偶见单个、数个透亮的类似骨髓瘤细胞,尚难判定是残留的瘤细胞或是早期的融合细胞。
    第3~4天,瘤细胞几乎完全消失,滋养细胞生长活跃,其中央有少数形似骨髓瘤细胞,浑圆透亮,成葡萄串状分布,少则3~5个,多则10余个,其细胞数与日俱增。
    第5~6天,小融合细胞集落继续长大,细胞透亮,可在培养板的盖板上画上克隆生长的标记。
    第7~9天,生长的细胞集落继续增大,可布满1/3或半个培养孔的面积,此时可取上清液检测相应的特异性抗体。
    4. 杂交瘤细胞的筛选 融合后的细胞在HAT培养基培养后,即有部分培养孔出现杂交瘤细胞集落,而其中仅部分是分泌预定特异性抗体的杂交瘤细胞。因此在培养7~10 d后用倒置显微镜观察到杂交瘤细胞长成约占1/3~1/2视野时,即可取培养上清液进行特异性抗体的检测,确定有无分泌单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb)的能力,以便及时进行细胞克隆化。检测McAb的方法可根据情况进行选择。
    5. 杂交瘤细胞的克隆化 细胞融合成功后,并经证实培养孔中存在预定抗原特异性抗体时,应尽早将杂交瘤细胞克隆化,其目的是利用单个细胞培养技术,从细胞群体中选育出遗传稳定而同源的细胞系,以获得分泌单一抗体的杂交瘤细胞系,淘汰遗传不稳定的杂交瘤细胞。每个杂交瘤细胞含有来自两种亲本细胞全套染色体,但在杂交瘤增殖过程中,将逐渐丢失染色体,甚而导致McAb产生能力的消失。因此,在筛选抗体阳性的杂交瘤细胞时,须尽早进行克隆化,以保持杂交瘤细胞具有同源的子代。克隆化多采用有限稀释法。
   (1)先制备小鼠饲养细胞层,将细胞悬浮与HT(融合后第一次克隆化时)或含10%FCS -1640培养液中。
   (2)用滴管将抗体阳性待克隆化细胞孔轻轻吹吸,使细胞与孔底分离,用培养液将细胞悬液稀释为每ml分别含5、10和50个细胞的悬液。
   (3)将上述稀释的细胞悬液分别加入已培养有饲养细胞的24孔培养板中,每孔0.1ml(2滴),使相应每孔分别含0.5、1或5个细胞。
   (4)将细胞培养板置于5%~7%CO2、37℃饱和湿度的温箱中培养,至第四天换培养液一次,第5~6天仔细观察各孔内细胞生长情况,并在相应的孔盖板上作标记,记录克隆生长的情况。
   (5)特异性抗体的检测:在克隆后的7~9天,在低倍镜下如见到细胞克隆布满1/3~1/2视野时,即可吸取培养上清液,用免疫学方法检测相应的抗体。如测出细胞生长孔含有特异性抗体,可选择抗体效价高、呈单个克隆生长、形态良好的细胞孔,继续同法再克隆扩大培养重复3次。如果有单克隆生长的每个孔内的上清都能检出高滴度抗体,则表明已经实现“克隆化”。
    6. 单克隆抗体腹水的制备 McAb因其具有高度特异性和能大量制备等特点,故生物试验和医药等领域得到广泛应用。将杂交瘤细胞接种与同系小鼠或裸鼠腹腔内,可诱生肿瘤和含McAb的腹水,并可有效保存杂交瘤细胞株和分离已经污染杂菌的杂交瘤细胞株。
   (1)在接种瘤细胞1~2周前,先给小鼠腹腔注射液体石蜡油或降植烷0.5ml,同批小鼠预处理后可用2个月左右。
   (2)1周后每只小鼠腹腔注射5×105~5×106杂交瘤细胞。先洗涤一次,以营养液调其浓度。
   (3)注射杂交瘤8~10天后,小鼠腹部明显胀大时,消毒小鼠腹部,用针头刺入小鼠下腹部,并轻揉其腹部,慢慢抽出腹水。一次抽5~8ml,待2~3 d后,腹水积聚,用同法反复抽,一般可抽2~3次。腹腔内产生肿瘤和腹水,抗体含量可达1 mg/ml。
    培养上清液中抗体含量低且混有大量血清蛋白,而腹水中虽然抗体含量高,但也混有蛋白,需进行纯化及鉴定其特性。

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