单克隆抗体技术

1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊断、预防和治疗提供了新的方法。
    1. 杂交瘤的基本原理　杂交瘤技术又称单克隆抗体技术(monoclonal antibody technique)。杂交瘤技术是使免疫动物的脾细胞在聚乙二醇（Polyethylene Glycol ，PEG）的诱导下与同系动物的骨髓瘤细胞融合。首先是细胞质融合，然后通过有丝分裂细胞核合而为一，形成新的杂交细胞，简称为杂交瘤。细胞融合后移入HAT培养液中培养。骨髓瘤细胞由于缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶（HGRPT），在HAT培养液中不能增殖而死亡。淋巴细胞培养中也不能长期在培养液中生长增殖。然而杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了HGPRT的基因产物，并从骨髓瘤细胞中获得肿瘤细胞不断生长繁殖（传代）的特性，因此在HAT培养液中选择性存活下来。细胞融合后既具有产生特异性抗体的能力。又保留了瘤细胞能体外长期培养的特性。
    2. 杂交瘤细胞制备
   （1）骨髓瘤细胞的培养：骨髓瘤细胞（NS-1或SP2/0）在含10～15的小牛血清完全培养液中培养处于对数生长期时，此时细胞浑圆、透亮，大小均一，排列整齐，呈半致密分布。选择处于旺盛生长，形态良好的对数生长期细胞供融合用。
   （2）免疫小鼠：选用8～12周龄雌性BALC/C小鼠免疫。如抗原为可溶性（蛋白质），可按每只鼠一次剂量为10～100μg/只免疫。蛋白质抗原与等量弗氏完全佐剂充分混匀，分别注入鼠的颈背部多处或腹腔内，间隔2～4周同法重复，经1月后，再用10～100μg（0.1～0.2ml）抗原作静脉或腹腔加强免疫。细胞与微生物表面抗原一般具有较高的免疫原性，可不加佐剂，直接经腹腔或静脉注入（1～2）×107细胞。一般采用融合前3～4d大剂量静脉注入抗原，然后取脾做融合实验。因此间脾脏B淋巴母细胞-浆细胞比例较高，融合率较高。
   （3）脾细胞制备：①放血处死小鼠，浸泡在75%的酒精中消毒。②在无菌条件下取脾，至含培养液的小平皿内，去掉脂肪和结缔组织，用5ml无血清培养液冲洗一次。③将脾细胞置细胞网上，加入5ml不完全培养液。用注射器内芯研磨分散脾细胞，将脾细胞收集到离心管内（50ml），加10～20ml培养液，离心（800～1000r／min，10min），弃上清后计数备用。
   （4）饲养细胞制备：在体外培养时，单个或少数分散的细胞不容易存活与繁殖，必须在加入其他活细胞才易存活与繁殖。通常在融合的前一天或当天用取小鼠腹腔巨噬细胞制作饲养层细胞。
    ①放血处死小鼠，浸泡在75%的酒精中消毒。②小心剪开腹部皮肤，用小镊子挑起腹膜，注入5ml无血清培养液，用镊子轻揉腹腔，将注入液体回抽，反复注入、抽吸2～3次。③将收集的细胞悬液注入50ml的离心管中，加20ml无血清培养液洗涤一次。④用含血清培养液（HAT）15～20ml调至4×105个细胞/ml，用吸管混匀后，接种到96孔板，每孔加0.1ml，置于37℃、5%CO2孵箱中。
   （5）细胞融合（杂交） ：①分别吸取含107个骨髓瘤细胞和108个脾细胞悬液，加入50ml的离心管中，充分混匀，并加1640培养液至20ml，离心（1000 r／min，10min）。②弃上清，用手指轻击离心管底部，使沉淀混匀如糊状。然后置37℃水浴中。③取预热37℃的50% PEG 0.7ml，1min内在37℃水浴中边滴边摇动加入离心管中，使细胞保持在均匀状态。然后在37℃水浴中静置1.5min。④立即在2min内加37℃预温的RPMI 1640培养液15ml，以稀释PEG而失去的作用。开始要一滴一滴加，即可见细胞凝集成小块。操作宜轻柔，不损伤细胞，以免影响细胞融合。⑤以1000 r／min，离心7min，弃上清液，加25ml HAT培养液，轻轻混匀，滴加入含有巨噬细胞饲养液的96孔板中，每孔0.1ml。
    3. 杂交瘤细胞的选择性培养
   （1）培养：将融合后的细胞悬浮于HAT培养液中，置于含5%～7% CO2，37℃饱和湿度培养箱中培养。
   （2）换液：每2～3天更换一半量的培养液一次，在融合两周内使用HAT培养液，在第12～13天用HT培养液，在第14天后根据细胞增殖情况改用15%～20%FCS完全培养液。
在停用A后，残留于培养液或细胞内的A仍起一定的阻抑作用，此时需继续补加HT培养液，为杂交瘤细胞提供应急的DNA合成途径。
   （3）观察：经融合剂PEG处理后的细胞，凝集成粗颗粒状。当天用倒置显微镜观察，可见2～5个粘连骨髓瘤细胞，常有融合的巨细胞或哑铃状的细胞。一次融合成功的杂交瘤细胞生长情况大致如下：
第1～2天，各培养孔中肿瘤细胞锐减，残存的瘤细胞成黯黑或折光性差，在巨噬细胞周围聚有破碎细胞，偶见单个、数个透亮的类似骨髓瘤细胞，尚难判定是残留的瘤细胞或是早期的融合细胞。
    第3～4天，瘤细胞几乎完全消失，滋养细胞生长活跃，其中央有少数形似骨髓瘤细胞，浑圆透亮，成葡萄串状分布，少则3～5个，多则10余个，其细胞数与日俱增。
    第5～6天，小融合细胞集落继续长大，细胞透亮，可在培养板的盖板上画上克隆生长的标记。
    第7～9天，生长的细胞集落继续增大，可布满1/3或半个培养孔的面积，此时可取上清液检测相应的特异性抗体。
    4. 杂交瘤细胞的筛选　融合后的细胞在HAT培养基培养后，即有部分培养孔出现杂交瘤细胞集落，而其中仅部分是分泌预定特异性抗体的杂交瘤细胞。因此在培养7～10 d后用倒置显微镜观察到杂交瘤细胞长成约占1/3～1/2视野时，即可取培养上清液进行特异性抗体的检测，确定有无分泌单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb）的能力，以便及时进行细胞克隆化。检测McAb的方法可根据情况进行选择。
    5. 杂交瘤细胞的克隆化　细胞融合成功后，并经证实培养孔中存在预定抗原特异性抗体时，应尽早将杂交瘤细胞克隆化，其目的是利用单个细胞培养技术，从细胞群体中选育出遗传稳定而同源的细胞系，以获得分泌单一抗体的杂交瘤细胞系，淘汰遗传不稳定的杂交瘤细胞。每个杂交瘤细胞含有来自两种亲本细胞全套染色体，但在杂交瘤增殖过程中，将逐渐丢失染色体，甚而导致McAb产生能力的消失。因此，在筛选抗体阳性的杂交瘤细胞时，须尽早进行克隆化，以保持杂交瘤细胞具有同源的子代。克隆化多采用有限稀释法。
   （1）先制备小鼠饲养细胞层，将细胞悬浮与HT（融合后第一次克隆化时）或含10%FCS -1640培养液中。
   （2）用滴管将抗体阳性待克隆化细胞孔轻轻吹吸，使细胞与孔底分离，用培养液将细胞悬液稀释为每ml分别含5、10和50个细胞的悬液。
   （3）将上述稀释的细胞悬液分别加入已培养有饲养细胞的24孔培养板中，每孔0.1ml（2滴），使相应每孔分别含0.5、1或5个细胞。
   （4）将细胞培养板置于5%～7%CO2、37℃饱和湿度的温箱中培养，至第四天换培养液一次，第5～6天仔细观察各孔内细胞生长情况，并在相应的孔盖板上作标记，记录克隆生长的情况。
   （5）特异性抗体的检测：在克隆后的7～9天，在低倍镜下如见到细胞克隆布满1/3～1/2视野时，即可吸取培养上清液，用免疫学方法检测相应的抗体。如测出细胞生长孔含有特异性抗体，可选择抗体效价高、呈单个克隆生长、形态良好的细胞孔，继续同法再克隆扩大培养重复3次。如果有单克隆生长的每个孔内的上清都能检出高滴度抗体，则表明已经实现“克隆化”。
    6. 单克隆抗体腹水的制备　McAb因其具有高度特异性和能大量制备等特点，故生物试验和医药等领域得到广泛应用。将杂交瘤细胞接种与同系小鼠或裸鼠腹腔内，可诱生肿瘤和含McAb的腹水，并可有效保存杂交瘤细胞株和分离已经污染杂菌的杂交瘤细胞株。
   （1）在接种瘤细胞1～2周前，先给小鼠腹腔注射液体石蜡油或降植烷0.5ml，同批小鼠预处理后可用2个月左右。
   （2）1周后每只小鼠腹腔注射5×105～5×106杂交瘤细胞。先洗涤一次，以营养液调其浓度。
   （3）注射杂交瘤8～10天后，小鼠腹部明显胀大时，消毒小鼠腹部，用针头刺入小鼠下腹部，并轻揉其腹部，慢慢抽出腹水。一次抽5～8ml，待2～3 d后，腹水积聚，用同法反复抽，一般可抽2～3次。腹腔内产生肿瘤和腹水，抗体含量可达1 mg／ml。
    培养上清液中抗体含量低且混有大量血清蛋白，而腹水中虽然抗体含量高，但也混有蛋白，需进行纯化及鉴定其特性。