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重组质粒中目的基因的分离与纯化

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先取少量纯化的重组质粒,用限制性内切酶切出目的基因,经电泳分离,确认。以200μl含2mg DNA(重组质粒)为例:取10μl含100μg DNA,加90μl TE。按1μg DNA加2-5U限制性内切酶,1/10体积缓冲液,1-2小时保温。缓冲液种类和酶反应温度因内切酶种类而异。1/10体积3mol/l NaAc,2倍无水乙醇,-70℃,2小时(-20℃过夜),10000rpm,10分钟离心,弃上清液(乙醇沉淀)。适量TE溶解沉淀(切断的DNA质粒与目的基因混合物),电泳分离(用相应分子量DNA标准同时电泳),在紫外光下观察结果,与标准DNA分子量比较,确认目的基因和内切酶的切割效果。
  经电泳确认后,取适量DNA(重组质粒)同上条件切开,用1.5%低熔点(<65℃熔解)琼脂糖凝胶,电泳分离。在紫外光下,切出含目的基因区带(凝胶),放入离心管中,提取纯化。
  从低熔点凝胶提取,纯化DNA片段。加与凝胶体积相等的TE(10mmol/l Tris-HCl pH8.0,0.1mmol/l EDTA),置65℃水浴5分钟保温,使凝胶完全溶解。待放至室温,加等量酚(TE饱和,TE封在上层,取下层酚),轻轻混匀(不用混匀),12000rpm,3分钟离心。反复1-2次。取上层液,加0.1体积3mol/L醋酸钠(pH5.2)和2.5倍体积无水乙醇,进行乙醇沉淀。将纯化的DNA加适量TE溶解,测定含量,备用(可用于目的基因结构分析,探针制备等)。除低熔点凝胶回收法外,如用一般凝胶可用透析带短暂电泳,离心管低部加玻璃棉,高速离心等方法回收DNA片段。

 

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