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目的基因的亚克隆

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目的基因的亚克隆

所谓亚克隆就是对已经获得的目的DNA片段进行重新克隆,其目的在于对目的DNA进行进一步分析,或者进行重组改造等。
    亚克隆的基本过程包括:(1)目的DNA片段和载体的制备;(2)目的DNA片段和载体的连接;(3)连接产物的转化;(4)重组子筛选。
一、试剂准备
1.LB液体培养基:胰化蛋白胨(细菌培养用)10g,酵母提取物(细菌培养用) 5g,NaCl 10g,加ddH2O 至1000ml,完全溶解,分装小瓶,15lbf/in2高压灭菌20min。
2.1.5%琼脂LB固体培养基: 称取1.5g琼脂粉放入300ml锥形瓶,加100ml LB,15 lbf/in2 高压灭菌20min,稍冷却,制备平皿。
3.IPTG、X-Gal
4.0.1M MgCl2 :15 lbf/in2高压灭菌20min,0℃冰浴备用。
5.0.1M CaCl2(以20%甘油水溶液配制):15 lbf/in2高压灭菌20min,0℃冰浴备用。
6.限制性核酸内切酶、T4 DNA连接酶。
二、目的DNA片段和载体的制备
    选择适宜的限制性核酸内切酶,消化已知目的DNA和载体,获得线性DNA,用于重组。根据目的DNA和载体的具体情况,选择一种或者两种适当的限制酶切割,分别产生对称性粘性末端(用一种限制性内切酶进行消化而产生带有互补突出端)、不对称粘性末端(用两种不同的限制性内切酶进行消化而产生带有非互补突出端)、平端。在亚克隆时,首选不对称相容末端连接,次选对称性粘性相容性末端连接,由于平末端连接效率较低,通常很少采用。但有时目的片段的末端与载体不匹配 ,一般先将不匹配末端补平,然后再以平末端连接。(实验操作同前述)
三、利用T4 DNA连接酶进行目的DNA片段和载体的体外连接
(一)连接要求和结果 

 

外源DNA片段末端性质
连接要求
          连接结果
不对称粘性末端
两种限制酶消化后,需纯化载体以提高连接效率
载体与外源DNA连接处的限制酶切位点常可保留;非重组克隆的背景较低;外源DNA可以定向插入到载体中。
对称性粘性末端
线形载体DNA常需磷酸酶脱磷处理
载体与外源DNA连接处的限制酶切位点常可保留;重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝;外源DNA会以两个方向插入到载体中。
平端
要求高浓度的 DNA和连接酶
载体与外源DNA连接处的限制酶切位点消失;重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝;非重组克隆的背景较高 。

 

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