甲基化敏感性高分辨率熔解(MS-HRM)

 

DNA 甲基化是发生在DNA碱基序列上的一种共价修饰。在哺乳动物中，DNA甲基化主要发生在5'-CpG-3‘双核苷酸序列的胞嘧啶上。在人类基因组中，大约有60%~70%的CpG胞嘧啶是甲基化的，其程度因不同的物种和细胞类型而异。DNA甲基化状态在基因组中呈现出一定的分布模式，90%的甲基胞嘧啶位于重复序列上。CpG岛广泛分布于启动子区域以及编码基因的第一外显子区。基因组这种甲基化谱式 （methylation pattern）在哺乳动物成体体细胞分裂时得到有效的维持，因而具有一定的稳定性。胞嘧啶甲基化这种共价修饰改变了DNA的结构特性与基因活动方式。

靶序列上甲基基团的存在可以影响转录因子的结合，引起转录抑制，从而使该基因表达受到抑制。启动子区CPG岛的甲基化常常可以抑制该基因的转录，尤其是对于抑癌基因，凋亡相关基因，DNA修复基因等，启动子区域发生甲基化会影响功能的发挥。不同的肿瘤组织基因甲基化状态不一样，可以作为早期检测，监测肿瘤形成的重要标志物。对于某些特异基因的甲基化，更加重要，如DNA修复基因，可以引起对化疗药物的敏感，从而作为药物治疗疗效的评价指标，指导临床用药。

MGMT基因在许多肿瘤中被认为是抗肿瘤药物治疗的预测标记。MGMT启动子肿瘤特异性甲基化，可以抑制MGMT蛋白的活性，从而使得肿瘤细胞对烷化类的抗肿瘤药物敏感，因而被广泛用于肿瘤化疗治疗。

目前，甲基化检测的方法很多，例如甲基化特异性PCR，Northern印迹法、Western印迹法、免疫细胞化学等，这些检测方法由于需要花费大量时间，成本高等等，在临床推广应用时均存在一定的困难。最新报道了一种基于熔解曲线的高分辨率熔解（High Resolution Melt，HRM）的新方法，为甲基化的检测带来了新的曙光。

高分辨率熔解（High Resolution Melt，HRM）是一种最新的遗传学分析方法，主要是根据DNA序列的长度，GC含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，其分辨精度可以达到对单个碱基差异的区分。主要是依赖于精确的检测DNA双链熔解荧光曲线，如同许多荧光PCR技术一样，HRM是利用了特定的染料可以插入DNA双链中的特性，从而对样品进行检测，HRM源于熔解曲线，原理与普通熔解曲线分析是一致的，二者不同之处主要表现在升温速率和所用的染料。

由于HRM的目的是能够对于单碱基差异进行区分，因此对温度分辨率的要求很高。Corbett Life Science公司新推出的Rotor-Gene 6000,其高分辨率熔解曲线每步升温0.02-0.1℃，仪器温度的精确度可以更加准确地检测荧光物质的改变。SYBR Green染料用于荧光PCR时，由于其本身属于非饱和性染料，对PCR有抑制作用，因此，在实验中的使用浓度很低，远低于DNA双螺旋结构中的小沟饱和的浓度，从而影响了检测的分辨率。一批新型商业化饱和染料的出现，如LC Green、SYTO9等等，具有更强的DNA结合能力和很低的抑制作用，为这一技术的使用提供了更有效的保障，从而大大提高了分辨率。

用HRM方法检测MGMT启动子区域内的甲基化状态，可检测低达0.1%的甲基化程度；并且可以根据已经甲基化程度的标准曲线对未知样品的甲基化百分比进行测定。因此，HRM可以作为一种高灵敏度的甲基化检测的新方法。除了可用于甲基化状态的检测，也可以广泛用于基因突变的的研究，等位基因频率分析，HLA基因组配型等等。

HRM方法操作简单、灵敏高、重复性高、成本低、不受检测位点的局限高度等等优势，将对于遗传学、肿瘤学等方面的研究和临床应用提供更大的帮助。