甲基化PCR

一、基因组DNA的提取

此步重点在于DNA的纯度，即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要。因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者。

使用两者的细节：

1. 蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20 mg/ml；

2. RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在购买市售RNA酶后进行再处理，配制成10 mg/ml。否则可能的后果是不仅没有RNA，连DNA也被消化了。两者均于-20℃保存。

3. 验证提取DNA的纯度的方法有二：

（1）紫外分光光度计计算OD比值；

（2）1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳。

二、亚硫酸氢钠修饰基因组DNA

如不特别指出，所用双蒸水（DDW）均经高压蒸汽灭菌。

1. 将约2 ug DNA于1.5 ml EP管中使用DDW稀释至50 ul；

2. 加5.5 ul 新鲜配制的3 M NaOH；

3. 42℃水浴30 min；

水浴期间配制：

4. 10 mM 对苯二酚（氢醌），加30 ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色）。

5. 3.6 M 亚硫酸氢钠（Sigma，S9000），配制方法：1.88 g 亚硫酸氢钠使用DDW稀释，并以3 M NaOH滴定溶液至pH 5.0，最终体积为5 ml。这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶，但加入NaOH后会慢慢溶解，需要有耐心。pH一定要准确为5.0。加520 ul 至上述水浴后溶液中。

6. EP管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀溶液。

7. 加200 ul 石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化。

8. 50℃避光水浴16 h。

一般此步在4 pm开始做，熟练的话不到5 pm即可完成，水浴16 h正好至次日8 am以后收，时间上很合适。

这一步细节：

（1）基因组DNA的量不需十分精确，宁多勿少，因为在以后纯化回收步骤中会有丢失，且此方法修饰最多可至4 ug。

（2）所有试剂均须新鲜配制，所以配液的技术要过关，既要快，又要精确。

（3）亚硫酸氢钠溶液呈强酸性，一定用碱将PH调制5.0，否则PH不合适会影响后续纯化吸收。

（4）水浴最好达16小时，虽可以短至8小时，但后者修饰会有不完全。

三、修饰后DNA纯化回收

EP管如无特别说明均为高压蒸汽灭菌的。

1. 将移液器枪头伸入石蜡油层下，先轻轻加压使其中一小段石蜡油排出，然后吸取混合液至一洁净1.5 mlEP管中。

2. 以下使用Promega Wizard Cleanup DNA纯化回收系统（Promega，A7280）

（1）70℃水浴预热DDW；配制80%异丙醇；

（2）加1 ml Promega’s Wizard DNA Clean-up resin，轻柔颠倒混匀，使DNA充分与树脂结合；

（3）由于该试剂盒中仅配备针筒没有针栓，如果有真空负压吸引器，使用起来很方便；如果没有，需要自备3 ml~5 ml 注射器。将注射器针筒与试剂盒提供的回收小柱紧密连接后，将上述混合物用移液器移至针筒内，用2 ml 以上的EP管放置小柱下接收废液。加针栓，轻轻加压，将液体挤出，此时可见小柱内有白色的树脂沉积。

（4）将注射器与小柱分离后拔出针栓，再将针筒与小柱连接，向针筒内加入2 ml 80%的异丙醇，插入针栓，轻轻加压，将异丙醇挤出。此为洗涤步骤。

（5）将注射器与小柱分离，将小柱置于洁净1.5 ml 洁净EP管上，离心12 000 rpm，2 min，以甩去残余异丙醇成分，使树脂干燥。此时，修饰后DNA处于与树脂结合状态。

（6）将小柱取下置于另一洁净1.5 ml EP管上，移液器加50 ul 预热好的DDW，室温放置5 min。

（7）离心12 000 rpm，20 s，此为洗脱步骤，此时EP管内液体即为洗脱的修饰后DNA溶液，终体积为50 ul。

3. 加5.5 ul 新鲜配制的3 M NaOH，室温放置15 min。

4. 加33 ul 10 M乙酸铵，以中和NaOH，使溶液pH于7.0左右。

5. 加4 ul 10 mg/ml 糖原，此作为沉淀指示剂，因为其与乙醇混合后可产生沉淀，便于以后离心后辨别回收物的位置，以防在吸取残余乙醇时将回收物吸走。其实，加入这些糖原究竟能起多大作用，不好说。不过有国产糖原卖，包装不大，也很便宜，买来一用，算严格遵守文献的步骤吧。

6. 加270 ul 冰无水乙醇，置于-20度，过夜沉淀。有人为沉淀最短可至2小时，但我认为时间长些可能会更好。并且做到此步骤时，一般会到中午，如果样本多的话要到下午，不妨放置过夜，日程可以轻松些，顺便做些其他试验。如果想当天做完，没有问题，但我认为最好多沉淀些时候，至少6小时吧。

7. 4度，12 000 rpm 离心，30 min，倒去上清液，收集沉淀。不必吸净。

8. 加500 ul 70%乙醇，不要将沉淀吹打起来，只要把乙醇加上即可。轻柔倾斜EP管，旋转一圈，再次离心，4度12 000 rpm，5 min。离心后倒掉上清，再加同量乙醇，同样再做一遍。此为洗涤步骤，共2次。

9. 倒掉上清，并常温简短离心后，将附壁乙醇离至EP管底，移液器小心将残余液体吸净，室温干燥5 min，或沉淀由不透明变为半透明或透明时，加入20 ul~30 ul DDW，溶解沉淀。至此，已完成了修饰后DNA的纯化回收，所得为修饰后DNA溶液，可用于此后的进一步实验。

10. -20℃保存DNA溶液。

此步细节：

（1）在使用注射器时，一定要用力均匀且轻，如使用暴力，会将小柱内的薄膜挤破，失去作用。

（2）乙酸铵、糖原不需新鲜配制，糖原配好后放在-20度保存，乙酸铵室温即可，因为这样浓度的乙酸铵非常难溶，一旦放在4度，取出用时也会有很多溶质析出。

（3）异丙醇、70%乙醇都不需要新鲜配制，但如果用量大，现场配也很方便。

此步关键是在树脂与DNA的结合上，这就再次强调第二部分调亚硫酸钠PH值得重要性。因为树脂与DNA结合需要有一个适当的pH，如前一步没做好，此步树脂不能与DNA很好结合，将会带来灾难性后果，即DNA随着液体被挤出了，洗脱时实际已没有任何DNA了。

四、修饰后DNA用于PCR

这一步也没有悬念。我主要谈一下这里面的几个比较棘手的问题：

1. 引物问题：我感觉自己设计引物有相当的难度，我曾设计过几对引物，并且试验了一下，但以失败告终。如果时间充裕、作的又是比较新的基因文献不多，自己设计引物没有问题。如果不是这样，还是参考文献更好些。首先查阅SCI分值高的文献，然后是著名实验室的文献，如果国内有做的，更好了，可以直接联系咨询。查到序列后，一定要和Genbank中的序列进行比对，防止有印刷错误造成的个别碱基的差别。然后再到google上搜一下，看用的人多否，体系条件是否一样。用的人多、体系条件一样，表明可重复性比较强。我也是按此行事，算比较顺利。

2. Taq酶问题：有文献用高保真的金牌Taq（Platinum），但我感觉只要体系正确、变性退火等条件合适，一般的热启动酶是可以的。我开始使用的是Takara的LA Taq，很好用，配有10x含mg2+的LA缓冲液。有时候用没了，暂时以Takara 的普通Taq酶也可以。如何选择，可以根据自己的情况。初作者还是用好一点的酶。

3. PCR的条件：变性一般都选择95度，3 min。其余我感觉还是根据文献，退火可以根据你的引物的退火温度在小范围内尝试。一般和文献报道差别不大。只是扩增片断特异性的问题。建议根据文献。

4. 做PCR的EP管最好选择进口的，壁薄且厚度均匀，这可以保证温度的迅速变化可以及时传递给管内的反应液，使体系真正在所设定的温度下运行。

5. PCR仪：如果在某一个仪器上作出来了，最好一直用此仪器继续。不同的仪器“脾气”也不一样，但EP管必要和仪器内的插孔紧密结合方好，留有空隙，我认为会影响温度的传递。

五、PCR产物的凝胶回收

这一步比较简单，可以购买一个凝胶PCR产物回收试剂盒，国产的就很好、价格也合理，比如TIANGEN的产品（用过）。把切下来的胶按说明书操作即可。

几个细节：

1. PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，要使用新配的电泳液。凝胶浓度1%-2%均可。

2. 凝胶DNA回收时在300nm紫外灯下观察条带位置，切取目的片断所在位置的凝胶，尽量小，保证特异性。

3. 紫外照射时间不能过长，否则对DNA有损伤。

4. 回收后的DNA如不马上用就储存于-20度，在数月内是很稳定的。

六、PCR产物与T载体的连接和转化、蓝白斑筛选

1. 连接T载体（本实验使用的是Promega的试剂盒）

15 ul 体系

T-easy 1 ul

Ligase 1 ul

2×buffer 7.5 ul

DNA 5.5 ul

4度，过夜。

2. 连接产物的转化

（1）-70度冰箱内取出感受态细菌，融化后置于冰上；

（2）连接产物15ul 全部加入，至于冰上30分钟；

（3）42度， 90秒钟；

（4）冰上2分钟；

（5）800 ul LB培养基；

（6）280 rpm，37度，摇床45分钟（将管放水平了摇，保证菌液摇匀）；

（7）8 000 rpm，1分钟；在超净台内去上清，留100~150 ul；

（8）涂板：37度孵箱过夜；（板为含有氨苄青霉素的固体LB培养基）

先涂：X-gar 35 ul

IPTG 25 ul

后涂：混悬液

过夜后可见板上长出很多蓝色或白色斑点，取白色斑点，尤其是蓝色斑点周围的白色斑点，此处自联率较低。

3. 取白斑，划种于新板上

新板：先涂：X-gar 35 ul

IPTG 25 ul

然后于板底划出分区，进行标记。根据需要，一般一板作50个克隆没有问题。

针头挑白斑划2道于板上相应区域内。

37度，孵箱过夜。

4. 联系测序公司送测序。一般一个克隆在35~45元。

这一部分的细节：

（1）涂板要均匀，保证Xgar和IPTG均匀分布在板面上；

（2）不要让蓝白斑长得太满，否则选取克隆时容易一下挑2个。