提高RT-PCR的灵敏度与产物长度
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摘要
RT-PCR 已经成为研究者确定感兴趣的器官、组织或细胞中mRNA 转录本出现、结构和表达水平的基本方法。RT-PCR的基本步骤包括:首先对样品中出现的所有mRNA 合成一个cDNA拷贝,接着扩增感兴趣的基因。因为两个步骤中使用的反应缓冲液不能兼容,所以这两个步骤(RT 和PCR)通常分别进行。即使有些试剂盒能将两个步骤合而为一,但是同样因为上述的缓冲液不兼容性,极大地限制了检测灵敏度。Eppendorf 设计了一个含有全新化学物质的新试剂盒,使一步法RT-PCR 更加有效,在两步法实验中可以获得更高的灵敏度。本文将对新试剂盒的表现进行检验。 下面的实验可以展示该试剂盒在不同应用中的表现。 实验1关注新试剂盒在一步法RT-PCR 中卓越的灵敏度。而在一步法应用中,最重要的因素就是能够采用尽可能少的目标材料进行有效工作。 实验2显示应用一步法方案进行长距离RT-PCR 不再是个难题。试剂盒中创新的缓冲液能同时保证逆转录酶和高保真酶混合物都具有最佳延伸性。 本系统提供的两步法RT-PCR 备选程序适用的模板范围很广。实验3描述了对不同模板的扩增情况。这个新的系统能为所有的RT目标提供全面解决方案,不论需要扩增的片段是中等长度还是极长,不同来源的总RNA 中转录本是低丰度还是高丰度。 材料和方法 Eppendorf cMaster RTplusPCR系统 Eppendorf Perfect RNA Eukaryotic试剂盒 所有的PCR反应均在Eppendorf Mastercycler® gradient梯度PCR仪上进行。 实验1:一步法灵敏度检测RT-PCR 扩增目标:500 bp 的人α微管蛋白mRNA 片段。 模板RNA:从人HELA细胞中纯化的总RNA。反应中应用的模板浓度从1μg递减至10pg。 方案:Eppendorf cMaster RTplusPCR系统,标准一步法RT-PCR方案。1:10 稀释RTplusPCR 缓冲液,镁离子终浓度2.5 mM,反应总体积50μl 循环参数:
实验2:一步法扩增长片段RT-PCR 扩增目标:5.3 kb 的人结节性脑硬化因子(hTSF)mRNA 片段。 模板RNA:从人HELA 细胞中纯化的总RNA。反应中应用的模板浓度为100 ng 和10 ng。 方案:Eppendorf cMaster RTplusPCR 试剂盒,针对长模板的特殊RT-PCR 方案。
设置一步法RT-PCR 反应。
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循环程序参数
如图2 所示,应用一步法RT-PCR 方法,可以从100 ng 和10 ng 总RNA 中检测到5.3 kb 的hTSF PCR 产物。这个PCR 反应非常困难,大多数RT-PCR 试剂盒生产厂家从未发布过应用一步法方案,有效扩增类似长度模板的结果。相反,Eppendorf 试剂盒能稳定可靠地从10 ng HELA 细胞RNA 中扩增该产物。
实验3:两步法RT-PCR
RT反应条件
注:动力蛋白的逆转录孵育时间延长至90 分钟。
~undefined_―― TNFR1
hTSF 和动力蛋白的三步循环方案
不同大小目的片段所采用的延伸时间和退火温度
结果