（交流）如何提高改良ELISA的灵敏度

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应用改良ELISA法检测某蛋白，购买标准的抗原肽，分子量比较小，直接包被标准的抗原肽，浓度已经达到了100ng/ml水平，过夜后经过洗涤，然后加入一抗，为纯化的IgG，浓度也比较高，为μg/ml水平，按着标准抗原肽和IgG的分子量来计算质量浓度，一抗应当足够和抗原肽结合了。加入一抗后37℃温育2h，洗涤，然后加入标记物（二抗），37℃温育1h，洗涤，再加入TMP底物A和底物B，显色反应20min，加入反应中止液，中止反应后在酶标仪上于450nm处测定OD值。OD值显示：高浓度标准抗原肽128ng/ml时OD值比较高，64ng/ml的OD值尚还可以，但是接下来的OD值均相当低，所有在作标准曲线时很难得到比较理想的相关系数，因为浓度比较小的抗原肽的OD值几乎相等，后面几点差不多在同一水平线上。而样本中的被检测蛋白的含量本来就比较低，所以灵敏度不够高，不知道该如何提高这种ELISA法的灵敏度？
具体的实验步骤及试剂如下：

1、包被液稀释的抗原（4、8、16、32、64、128ng/ml），用移液器小心将抗原液100μl加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可产生气泡。每个浓度加4孔（4个复孔），对照孔4孔加入相同体积的包被液；其中两孔加入100μl样本。用保鲜膜包好酶标板，将酶标板放入底部垫有湿砂布的铝盒中，放入4℃中包被过夜。
2、洗涤：将酶标板孔中的包被液倾干净，并反扣在干净的吸水纸上拍干，加入洗涤液洗涤进行洗涤。采用浸泡式洗涤法，将洗涤液注满板孔，放置3min，间歇摇动，浸泡时间不随意缩短，吸干孔内洗涤液，也可甩去洗涤液，反扣在吸水纸上拍干。重复洗涤4次。
3、封闭：在酶标板孔的底部加入封闭液200μl，室温下封闭1h。
4、1h后将酶标板孔中的封闭液倾倒干净，并反扣在干净的吸水纸上拍干，然后每孔中加入一抗使用液100μl，注意将抗体液加在酶标板孔的底部，避免加在孔壁上部。用保鲜膜包好酶标板，将酶标板放入底部垫有湿砂布的铝盒中，并在铝盒中放一装有少量水的烧杯，在37℃温箱中放置2h。
5、2h后取出酶标板，倾倒干净酶标板孔中的一抗溶液，并反扣在干净的吸水纸上拍干。洗涤4次，洗涤方法同2。
6、在酶标板孔中加入梅标二抗1:4000倍稀释的溶液100μl，加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可产生气泡。用保鲜膜包好酶标板，将其放入底部垫有湿砂布的铝盒中，并在铝盒中放一装有少量水的烧杯，在37℃温箱中放置1h。
7、取出酶标板，倾倒干净孔中的二抗溶液，并反扣在干净的吸水纸上拍干，按2洗涤方法洗涤4次。
8、在酶标板每孔中加入底物A液50μl，底物B液50μl，反应15min～20min后，在每孔中加入反应中止液50μl，在中止反应后15min时在酶标仪上于450nm处测定OD值。

试 剂
1、包被液（PH9.6，0.05M碳酸盐缓冲液）：Na2CO3 0.795g，NaHCO3 1.465 g，加超纯水至500ml，4℃保存备用。
2、洗涤液(PH7.4，PBST缓冲液)：KH2PO4 0.1g，Na2HPO4•12H2O 1.45g， NaCl 4.0g， KCl 0.1g， Tween-20 0.5ml，加纯水至500ml，4℃保存备用。
3、稀释液（临时配制）：上述PBST缓冲液50ml，加BSA 0.5g，即1％BSA-PBST溶液，4℃保存备用。
4、封闭液（临时配制）：与稀释液相同。