逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)的原理

组织或细胞中的总 RNA, 以其中的 mRNA 作为模板 , 采用 Oligo(dT) 或随机引物利用逆转录酶反转录成 cDNA. 再以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增 , 而获得目的基因或检测基因表达 .RT-PCR 使 RNA 检测的灵敏性提高了几个数量级 , 使一些极为微量 RNA 样品分析成为可能 . 该技术主要用于 : 分析基因的转录产物 , 获取目的基因 , 合成 cDNA 探针 , 构建 RNA 高效转录系统 .

<font> </font> <font><span> </span> <span><span> </span> </span> </font> <font><b><span>Trizol</span> </b> <b><span>法</span> </b> <b><span>RNA</span> </b> <b><span>提取步骤</span> </b> </font>

<font><span>标记</span> <span>EP</span> <span>管，分</span> <span>3</span> <span>组</span> </font>

<shapetype><stroke> <formulas><f> <f> <f> <f> <f> <f> <f> </f></f></f></f></f></f></f></formulas> <path> <handles><h> </h></handles> </path></stroke></shapetype> <shape><font> </font></shape><font> <span><font><span> </span> </font> </span></font>

<font><font><font><span>第一组</span> <span>EP</span> <span>管加入氯仿</span> <span>0.2ml</span> <span>，二组加入异丙醇</span> <span>0.5ml</span> <span>，三组加入</span> <span>75%</span> <span>乙醇</span> <span>1ml</span></font></font></font>

<font><font><shape><font> </font></shape><font> <span><span> <font> </font> </span> </span></font></font></font>

<font><font><font><font><span>1ml Trizol</span> <span>、心或肺</span> <span>50</span> <span>～</span> <span>100mg</span> <span>、液氮依次加入到研钵中，研碎</span> </font></font></font></font>

<font><font><font><shape><font> </font></shape><font> <span><font><span> </span> </font> </span></font></font></font></font>

<font><font><font><font><font><font><span><span> </span> </span> <span><span> </span> </span> <span>收集组织液</span> <span>1.5ml</span> <span>至</span> <span>EP</span> <span>管，离心：</span> <span>15000rmp</span> <span>、</span> <chmetcnv><span>4</span> <span>℃</span> </chmetcnv> <span>、</span> <span>15min<span> </span> </span> </font></font></font></font></font></font>

<font><font><font><font><font><shape><font> </font></shape><font> </font></font></font></font></font></font>

<font><font><font><font><font><font><font> </font> </font></font></font></font></font></font>

<font><font><font><font><font><font><font><b><span>取上清</span> </b> <span>，转移至氯仿组，摇晃</span> <span>15s</span> <span>，冰上放置</span> <span>10min</span></font></font></font></font></font></font></font>

<font><font><font><font><font><font><shape><font> </font></shape><font> <span><font><span> </span> <span> </span> </font> </span></font></font></font></font></font></font></font>

<font><font><font><font><font><font><font><font><font><span>离心：</span> <span>15000rmp</span> <span>、</span> <chmetcnv><span>4</span> <span>℃</span> </chmetcnv> <span>、</span> <span>15min</span></font></font></font></font></font></font></font></font></font>

<font><font><font><font><font><font><font><font><shape><font> </font></shape><font> <span><font><span> </span> </font> </span></font></font></font></font></font></font></font></font></font>

<font><font><font><font><font><font><font><font><font><font><font><b><span>取上清</span> </b> <span>，转移到异丙醇组的</span> <span>EP</span> <span>中，冰上放置</span> <span>20min</span></font></font></font></font></font></font></font></font></font></font></font>

<font><font><font><font><font><font><font><font><font><font><shape><font> </font></shape><font> <span><font><span> </span> </font> </span></font></font></font></font></font></font></font></font></font></font></font>

<font><font><font><font><font><font><font><font><font><font><font><font><font><span>离心：</span> <span>15000rmp</span> <span>、</span> <chmetcnv><span>4</span> <span>℃</span> </chmetcnv> <span>、</span> <span>15min</span></font></font></font></font></font></font></font></font></font></font></font></font></font>

<font><font><font><font><font><font><font><font><font><font><font><font><shape><font> </font></shape><font> <span><font><span> </span> </font> </span></font></font></font></font></font></font></font></font></font></font></font></font></font>

<font><font><font><font><font><font><font><font><font><font><font><font><font><font><font><b><span>弃上清</span> </b> <span>，加</span> <span>75%</span> <span>乙醇</span> <span>1ml</span> <span>（</span> <span>0.1%DEPC</span> <span>水配制）</span> </font></font></font></font></font></font></font></font></font></font></font></font></font></font></font>

<font><font><font><font><font><font><font><font><font><font><font><font><font><font><shape><font> </font></shape><font> <span><font><span> </span> </font> </span></font></font></font></font></font></font></font></font></font></font></font></font></font></font></font>

<font><font><font><font><font><font><font><font><font><font><font><font><font><font><font><font><font><span><span> </span> </span> <span><span> </span> </span> <span>离心：</span> <span>15000rmp</span> <span>、</span> <chmetcnv><span>4</span> <span>℃</span> </chmetcnv> <span>、</span> <b><span>5min</span></b></font></font></font></font></font></font></font></font></font></font></font></font></font></font></font></font></font>

<font><font><font><font><font><font><font><font><font><font><font><font><font><font><font><font><shape><font> </font></shape><font> <b><span><font><span> </span> </font> </span></b></font></font></font></font></font></font></font></font></font></font></font></font></font></font></font></font></font>

<font><font><font><font><font><font><font><font><font><font><font><font><font><font><font><font><font><font><font><b><span>弃上清</span> </b> <span>，干燥</span> <span>15min</span> <span>，加</span> <span>100ul DEPC</span> <span>处理的水</span> </font> </font></font></font></font></font></font></font></font></font></font></font></font></font></font></font></font></font></font>