RT-PCR之我见

互联网2013-09-06

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本文讨论的范围包括RNA酶保护分析，northernblot，原位杂交，半定量RT-PCR 和定量RT-PCR 。本文不谈具体protocol，是因为各种书籍和kit说明书上都有，主要说一些原则，而且大部分是失败和成功的经验，还有小组讨论结果以及各种书里七零八落看的内容，希望对大家有用。

基因表达的定义： 说到基因表达，是指RNA，还是蛋白？是指mRNA还是包括风头正旺的非编码RNA？mRNA还有不翻译的RNA呢。应该说转录水平指的是RNA水平，而蛋白应该叫翻译水平？我们这里就特指编码蛋白的mRNA的量的检测吧！ 方法： 很多很多，我们常用的也就是RT-PCR 和northern。RNA没保护分析在国外很常用，也有半定量的功能，一次性试剂盒还能以此将一个表达簇一起分析，例如NFkB的转录激活谱中的8个常见基因。dot blot的最大贡献是发展到了反向dot blot的顶峰��曾经无限时髦的基因芯片，而原位杂交的放大效应和它的假阳性使它的定量（半定量，应该根本算不上定量），用它定位和用蛋白定位的意义不可同日而语，又难做，只有新发现的基因可以在没有得到蛋白和抗体的情况下进行组织或者细胞定位。

先谈谈RT-PCR 吧。关于原位杂交和dot blot大家可以和我论战的，我曾经看到一篇公开发表的文章把dot blot称为定量检测，是极端错误的。 1、模板均一性问题：愚见采用从RNA定量的方法似不妥，不要说PCR 的本身的敏感度，即便是在反转录就有差异，到了cDNA 的分装和用于模板的取样，这些都不能保证准确，当然在反转录阶段我们也经常控制在1或5ug，但这是为了再将来加样的时候保证大致差不多，而且尽可能地利用反转录酶，而且RNA定量本身即使用电泳 也不是那么准，更不要说分光光度计，这里说一下，我曾经看到有人说用分光光度计定量，这也不是很准确，分光光度计只是掌握大概，当然用于反转录足够了，但是用于rt－pcr的定量这是不正确的，很不准的，RNA也最好至少要用电泳 ，一方面定量，另一方面可以看看完整性。至于用分光光度计比较不同标本之间就更不准了。 2、RNA制备：一般制备总RNA 即可，有时需要制备mRNA，个人认为初学者还是选择Trizol，大量制备采用传统的方法自己配，实际上和trozol一样的，有时效果还好，trizaol也就是混一混，但是优点在于质量保证，使用方便，效率高，根据不同组织用trizol一般可以提到全部RNA的50%（别小看，这已经很高了）以上，有些可以到达80%。mRNA用Qiagen的柱子，别去自己做Oligo（dT）柱，太麻烦。是否用DNA seI根据基因的特点和引物的设计，能够跨内含子的就不需要处理，处理还是很危险的哦。像这样的微量和也用不了多少次的实验，并且如果牵涉到样品是无价之宝的时候，因该选好的进口试剂。谈到RNA的贮存实际上主要是温度，至于放在TRIZOL中是不可取的，更不要说在胍里了，只－20是不够的，至少－80，液氮最保险，想想，在低温里，即使加上些RNA酶它也降解不了哇！qiagen出了一种easy产品可用于保存标本，但在常温也只是1天，所以低温才是首要的，抽的时候也是这样。 3、反转录：常规，取样尽量一致，如上所述，不是为了定量，是为了半定量PCR 时图形的好看。选择逆转录酶根据实验需要，少量的可用Promega的一种1ug的酶，多的我们用invitrgen的5ug的II，当然有人说Promega和Roche的也不错，用过，的确可以，要不Invitrogen不像当初Gibco时那么牛了，也降价打折了。反转录成功后就不必太小心了，放在那里都可以，想想你还曾经72度灭活呢，是不是？要知道，杂合双链比DNA 双链还稳定的。一般来说要扩增从反转录到PCR 全过程的长达2kb以上的片断是相当困难的事，很多长基因是通过随机引物库得到的而不是通过oligo （Td）得到的，不要说反转录,即使是PCR 也是很困难的，不信可以从质粒里试试,至于反转录，就更是天方夜谭了，除了酶的效率等,还有RNA的二级结构等因素，这就要一些大公司的特殊的名贵的效果也未必好的酶了，Ｒoche和Invitrogen都有的.听天由命吧。

4、半定量RT-PCR ：重点，为什么是第4条？首先说明一下，半定量PCR ，我是指基于凝胶成像分析的，定量PCR 指实时PCR 。 实验设计： 根据不同的实验，对于不同的基因要有不同的策略，还有不同的组织，选择不同的基因的转录本，选择不同的看家基因，都各自不同，对于文献不可照抄。 引物： 对于RT－PCR 重要的是引物的位置，有两种方法，一种是上下游引物设计在跨内含子的两个外显子的3’端和下一个外显子的5’端，这样不会在基因组上扩出来。第二种是我最喜欢的，设计在两个离得远的外显子上，这样从基因组和cDNA 上得到得不一样，可以一引两用。以上原则对单外显子基因不使用，这是最好选择DNA aseI处理。另外，我们有一个好习惯，就是把退火温度设计成一样的，这样每次做的时候不用“三查七对”，从冰箱里拿出就坐。另外3'最后一个碱基是很重要的。

昨天看到有人问5‘端得问题，本来以为这是大家都知道的，也在这里顺便说说，表达水平检测和开放读框没有关系，PCR 的位置不需要在读框里，相反3’非翻译区反而同源性最低。而且如果用的是oligo（ dT），用3端更保险。再说一句，我从不用软件，全靠两只眼睛看，每每用一个上午，想想还有基因组呢，只看得两眼昏花。设计好以后，最好在查一下有没有同源序列，尤其是一个家族的基因。 关于mRNA和蛋白的一致性，mRNA是不能代替蛋白水平的分析的，因为还有翻译效率和RNA降解速度的影响，当然还有蛋白的剪切和分解速度等等，但是表达水平一般来说可以大致估计一种基因的翻译产物的，有时。但二者不能混委一谈。 基因组问题： 如上所述，可以不用处理基因组的。但是如果是单外显子呢？曾经有以为朋友问我，她的样品中总是有基因组的污染，用RNA去p总能P出来。她先用trizol过两遍，再用qiagen过两遍，还能P出来。这是很多人碰到的问题，问题的关键是TAQ（除了具有DNA 指导的）还有RNA指导的DNA 聚合酶功能，所以是可以直接从RNA中P出来的！那就冒险让RNA高温一下吧，只是DNA ase处理时一定小心，买大公司的，保险一些，至少也应该是takara的，买液体做好的，不要自己配，比起标本来，这时候银子已经退居其次了。 长度： 我们认为500之内比较好，不受中间可能出现的各种序列和二级结构的影响。至于eeflying说的跑的在前会弥散则可以用2％的胶就行了。我一般是250左右。目的基因和内参照之间的大小比例可以根据爱好和胶的浓度、分辨率调整的。如果是250，则相差100bp很好，如果4、500则差个200bp也可以。 内参照： 每一次一定要做内参。不作内参的结果是不可信的，实际上我想大部分半定量RT－PCR 本身就是不可信的，不过我做的是可信的，因为我反复摸，重复做，每次作内参照，跟自己对照，用不同的酶，不同的体系，作出同样的结果（基因表达结果，不是条带什么的）。

不管多少样品，内参不作，等于说比较珠穆朗玛峰和泰山的高度一样，没有海拔，泰山从地面的高度和珠穆朗玛峰从青藏高原的高度没什么差别。PCR 一定要同时作，但是电泳 可以不一起跑，没有关系，记住，计算的是相对表达程度，再说一遍我的观点：1、半定量和定量RT-PCR 做的都是基因相对表达量，不是绝对表达量，除非你能准确知道来自多少细胞，但是细胞还有死的呢。2、以电泳 为基础的半定量RT-PCR 本身是不可信的，作为实验的粗筛是可以的，但不能作为最终结果的，不过我的可以。3、半定量RT-PCR 应该在两管中进行，除非内参基因和目的基因表达相同，长度一致，目的扩增区域的GC含量相似，或者实在穷的要省PCR 管和Taq酶。

解释一下： 1、同一管中不是不可以，因为它有条件现同的优点，只要目的基因的扩增量和选择的不同循环数的内参照基因的最终扩增产量大致相同就很好，很拗口吧。但是一管中的竞争抑制实在是大问题，即使对照组一致了，咱做的是差异，总有不一致的，而且PCR 的放大效应会把芝麻P成西瓜的哦。在不同管中重要的模板的平均分配，这不用多说了把。2、相对和准确的问题，PCR 的相对定量是因为引入了内参照，所以没有绝对定量一说，至于半定量和定量的区别不是相对和绝对的区别，而是准确和不准确的区别。一般经常搞错的定量半定量和绝对量相对量的概念，定量半定量是指检测准确度，而绝对量相对量是指基因在组织中的表达丰度，例如Northen虽然不是很准（Northern不是很好的金标准），主要是上样量的原因，不管使用28s18s定还是用SB GAPDH或者β-actin都是，但是Northern得出的是绝对组织丰度，而实时荧光定量RT-PCR 虽然准确（定量）但是得出的是相对表达丰度，不管使用β-actin还是用18srRNA。至于常规的通过跑电泳 的所谓“定量”RT-PCR 那就远了去了。 另外，似乎有人认为要做的好，就要把条件摸得哈好的，一旦很好，就不更改，PCR 条件，徨论Taq酶，窃以为实不足取，为何？我说的“摸”是指循环数和模板，如果连taq也要固定下来，其不是别人重复不了了？因为检测的是相对量（反复强调），所以理论上在PCR 过程和成像过程只要在线性期，结果应该是差不多的，为什么不说一样是应为即使在线性期也是有差异的，大家看看文后的我们做的定量PCR 的图就知道了，在每个点的切线的斜率是不同的。

关于选择什么作为内参照的问题，实际上没有定论，个人认为，18s优于actin，不要跟我说GAPDH，著名的GAPDH都可以说是肿瘤相关分子了，其它还有tubulin什么的，因该差不多，实际上actin虽然相对来说很稳定的表达量，但我想在细胞分裂的过程中，需要骨架，因此actin等本身在不同细胞，不同组织、不同时期是变化的，我想，姑妄听之。作为骨架蛋白和细胞的分裂发育是密切相关的，在不同状态表达是不同的，不同细胞等。之所以用18s是因为相对而言核糖体RNA量相对稳定，因为它的功能是同整个基因谱有关的（负责装配），更重要的（我想的）它在总RNA中占地比例高，所以更准确，就像你用某一种东西的数量去概括总量，应该选那种多的，说一座房子是由2000块砖造成的，比说用29根梁更准确吧，当然你用的是mRNA就另当别论了。 摸： 一定要摸，关键是摸，摸上3、5摸总是必要的，首先分开一个一个摸，然后再放到一起摸（特指同管PCR ），直到摸的好了，还要考虑比较的不同的模板中的量，这就是因为下面谈到的线性期和平台期的问题。 线性期和平台期： 根据上面摸的结果，选择线性期的起始周围的循环数作为PCR 指数，这和定量PCR 中的原理是一样的，这相当于取线性期曲线的切线（是不是这样？）。线性期似乎因该是指数期（我想的），只是因为2的幂和倍数正好一样？不要为了后期的亮度取线性期的晚期，那样是不准的，文后复一张自备的定量RT-PCR 的图参考就明白了。本来想把模板量单列的，在这里说了吧，模板量应该越多越好，当然是指在条件允许和不影响PCR 体系的情况下，也不是指把20ul都加上，还要摸呢，对吧。一般来说2ul要比1ul好，很多人会问，过了一个循环不久一样了么？不一样的，这和PCR 本身的原理有关，什么原理我也不懂。就像到了线性期，很多人会说，再加酶，实际上不是的，再加酶和dNTP还有引物都没用的，其实这些本身就是过量的。

综合上面两点，说说下面一点： 一般摸出来的结果是什么呢？个人认为，再使用1ugRNA反转录后用2－4ul为模板和使用5ug反转录用1－2ul为模板的情况下，一般目的基因很少超过30循环，著名的β－actin很少超过25循环，如果你看到有人用actin和sb GAPDH超过28－30循环的话，结果是不可信的，实际上即使超过25循环也是值得商榷的，肯定再RNA或者cDNA 的步骤有问题，此时因该增加模板量，而不是增加循环数，即使目的基因要用30以上也要考虑一下。对于想脾脏这样的组织，actin甚至可能要低于20循环，实际上在后文谈到的凝胶成像仪的检测范围之内，应该循环数越少越好。还是那句话，并不是在指数期就可以的。 提示： 另外，不是很亮（跑电泳 时）并不代表没有到平台期，再看看我们的做的定量PCR 的图就明白了，有些基因的平台期是达不到很高的（这不是因为荧光标记得影响），要看你摸的时候不同循环的扩增产物的量之间的关系，在相邻之间的差异基本复合线性增长才是线性期。

一步法还是二步法：我一直不建议采用一步法，因为逆转录酶很贵，就做一次PCR ，多可惜啊！还有RNA。而且反转录了之后可以做10－20次，还可以摸条件找原因。不要以为一步法是盒子，实际上是一样的，操作没有什么不同，还没办法摸条件，早该淘汰了（特指RT-PCR 过程中）。对于少量的标本用1ug的反转录酶既可以了，或者用于预实验都是很好的，但是P的时候要多加一点，之所以这些话总是不确定是因为还和你正在做的基因的风度有关。 关于凝胶成像分析： 这是常人所未想的问题（晕倒一片），一般来说基于CCD的成像系统也有这个问题，这就是CDD本身的工作原理和软件的质量，有的CCD是重复扫描的，有的软件是只有256灰阶的，所以要注意上样量不要太多，当然也不要太少（以防看不到），否则会超出扫描CCD和软件的分析范围，这和PCR 到线性期就没有什么不同了。另外很多软件有手动调节，这样的软件使用时要保持每次框起来的范围的大小的一致性，不要造成太多的人为误差，号召大家不要任意修改数据。此外，紫外灯管的质量、光的强度、均一性和CCD距离、焦距、分辨率都要注意。如果有钱买冷CCD当然最好了，不过其实一般用不着。实在不行的，拍了照再扫描再用photoshop分析也未尝不可，但是那可是很不准的，中间不周太多，而且如果是热敏打印机很容易亮度饱和的，不一定会有灰阶。 PCR 反应： 常规PCR 什么的，实际上Mg2 什么的没有那么重要的，退火温度什么也没有什么的。别忘了两对引物的退火温度相同哦，即使在两管中也要这样，因为在一台PCR 仪上，如果在一管中，还要考虑4条引物之间不互补。 复孔的问题： 其实用这个办法很容易解决一些判断问题，作三个复孔很好，这在定量PCR 常用对吧?但是如上文所属，如果模板足够多，这步可以省去去的。 定量PCR ：其关键在于准确和起始模板可以微量，但也只是相对定量，特指RT-PCR ，这里不讨论根据标准曲线检测基因啊病毒啊什么的绝对值。为什么是准确的相对定量，我再废话一会again，是指你不知道你的模板来源是多少，所以才用GP内参，话说回来，及时你知道多少个细胞，还有细胞生死的问题对不？这就是为什么说northern是不很准确（没有定量PCR 准确）的绝对定量，是因为northern的模板多，综合分光光度计和28s/18s更复合实际情况些，尤其是在不同组织分布的研究中更有效。

1、原理：毕竟，PE是定量PCR 的鼻祖，而且型号也一直在推陈出新。bio－rad和roche的也是很强的，各有优势，大家还是比一比，价格、功能、性能、服务，尤其是技术支持，有些公司的技术支持强可以帮我们很多忙的。还有最近基因公司也有一种新的不错的。

2、 Taqman：常见原则，方法简单，原理易懂，结果可靠。同管不同管和上面一样的，只是还多了问你的仪器有没有双波长检测滤镜，而且双波长有时在一管中也有影响。

3、仪器选择：PMT和CCD各有千秋，不要听信一家之言。能兼容96孔板和普通PCR 管的最好，96控板便宜而且一致性较好，至于边缘效应实际上没有那么明显得，只要做个对照就明白了。最好能兼容各种方法、试剂和耗材的，以防后“费”无穷。速度不重要，但是其中一家公司的变性时间短也是不容小觑的优势，对整个实验速度还有TAQ酶的影响小，当然没有也没大关系，毕竟taq现在都很好。

4、结果分析：要注意不同的探针的标记效率，分开设域值线还是放在一起要根据实际情况，即目的基因和参照基因的CT值的差距，CT（还是T，很想CS嘛）的倍数也可以改的。 总结一句，（我最在行的）半定量RT-PCR 一般来说基本上是g p。

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