免疫荧光染色技术

互联网2013-09-06

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抗原物质

固定剂

固定条件（ min ）

蛋白质抗原

95% ～ 100% 乙醇

室温 3 ～ 10

酶、激素

丙 酮

4 ℃ 30

免疫球蛋白

四氯化碳

病 毒

丙酮、四氯化碳、无水乙醇

室温 5 ～ 10 或 4 ℃ 30 ～ 60

多糖、细菌等

微火加热，甲醇、 10% 甲醛、丙酮

类 脂 （异嗜性抗原）

10% 甲醛， 10% 佛茂尔（ ForMol ）

室温 3 ～ 10

（三）水洗

固定后以冷的 0.01Mol/L pH7.4PBS 液浸泡冲洗，最后以蒸馏水冲洗，防止自发性荧光。

（四）染色

染色分直接染色法与间接染色法。

1． 材料与试剂

（ 1 ）荧光抗体，稀释至应用浓度。

（ 2 ） 0.01Mol/L pH7.4PBS 液

（ 3 ） 9 份优质甘油加 1 份 pH7.4PBS 液即为甘油缓冲液。甘油有减少非特异性荧光的作用。

（ 4 ）带盖方盘

2 ．直接染色法

（ 1 ）将固定好的玻片置于湿盘中，滴加荧光抗体染色液，以覆盖为度，加盖， 37 ℃感做 30 min ～ 45min 。

（ 2 ） PBS 冲洗 3 次，每次冲洗 3min ，即 3 × 3 � 冲洗。

（ 3 ）蒸馏水冲洗。

（ 4 ）滴甘油缓冲液一滴，封片，荧光显微镜检查。

2． 间接染色法

（1） 检查抗原：①取固定标本，加已知的免疫血清， 37 ℃ 孵育 30min ；②以 PBS 液 3 × 3 � 冲洗；③再加荧光标记的抗抗体， 37 ℃ 孵育 30min ；④ PBS 3 × 3 �冲洗；⑤ H2 O 冲洗，凉干；⑥加甘油缓冲液，封片、镜检。

（2） 检查抗体：①以免疫后动物的淋巴组织涂片，自然干燥，甲醇固定；②滴加相应抗原液（按 1 � 100 ～ 1 � 500 稀释）， 37 ℃ 孵育 30min ；③ PBS 液 3 × 3 �冲洗；④ 加荧光抗体， 37 ℃ 孵育 30min ；⑤ PBS 液 3 × 3 �冲洗；⑥ 水洗，凉干；⑦加甘油缓冲液，封片、镜检。

荧光显微镜所观察到的图象，主要以两个指标判断结果，一个是形态学特征；另一个是荧光的亮度，在结果的判定中，必须将二者结合起来，综合判定。

荧光强度的表示方法如下：

＋＋＋ ～ ＋＋＋＋：荧光闪亮，呈明显的亮绿色。

＋＋ ：荧光明亮，呈黄绿色。

＋ ：荧光较弱，但清楚可见。

± ：极弱的可疑荧光。

－ ：无荧光。

（六）标本保存

由于荧光色素和蛋白质分子的稳定性都是相对的，因此随着保存时间的延长，在各种条件影响下，标记蛋白可能变性解离，失去其应有的亮度和特异性。因此给标本的保存带来一定的困难，所以在标本进行荧光染色之后应立即观察。

保存的方法可采取以下几种：①固定标本片以后低温保存，随用随染；②染色片采取优质封固剂，如特别的荧光封固剂（ Fluormount ）或碱性优质纯甘油固剂等封固。这些封固剂能防止荧光激发，封固后低温保存；④可以采用拍照保存照片。