免疫荧光染色方法
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选无自发性荧光的石英玻片或普通优质玻片，洗净后浸泡于无水乙醇和乙醚等量混合液中。用时取出用绸布擦净。将待检样品如组织块剪成适当大小印压于玻片上。也可采用冰冻切片或石蜡切片样品。
（二）固定
除研究细胞表面抗原或不稳定抗原可不固定外，一般均应固定。固定的作用有三： ① 防止标本从玻片上脱落； ② 除去防碍抗原—抗体结合的类脂，使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果； ③ 固定的标本易于保存，如组织切片固定后在 -20 ℃ 下可保存一年而不改变其染色特性。
标本的固定原则是：①不能损伤细胞内的抗原；②不能凝集蛋白质；③不能损伤细胞形态；④固定后应保持细胞膜的通透性，以允许抗体进入与抗原结合。
表 常用抗原物质的固定方法
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抗原物质 |
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固定剂 |
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固定条件（ min ） |
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蛋白质抗原 |
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95% ～ 100% 乙醇 |
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室温 3 ～ 10 |
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酶、激素 |
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丙 酮 |
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4 ℃ 30 |
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免疫球蛋白 |
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四氯化碳 |
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病 毒 |
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丙酮、四氯化碳、无水乙醇 |
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室温 5 ～ 10 或 4 ℃ 30 ～ 60 |
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多糖、细菌等 |
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微火加热，甲醇、 10% 甲醛、丙酮 |
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室温 5 ～ 10 或 4 ℃ 30～60 |
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类 脂 （异嗜性抗原） |
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10% 甲醛， 10% 佛茂尔（ ForMol ） |
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室温 3 ～ 10 |
（三）水洗
固定后以冷的 0.01Mol/L pH7.4PBS 液浸泡冲洗，最后以蒸馏水冲洗，防止自发性荧光。
（四）染色
染色分直接染色法与间接染色法。
1． 材料与试剂
（ 1 ）荧光抗体，稀释至应用浓度。
（ 2 ） 0.01Mol/L pH7.4PBS 液
（ 3 ） 9 份优质甘油加 1 份 pH7.4PBS 液即为甘油缓冲液。甘油有减少非特异性荧光的作用。
（ 4 ）带盖方盘
2 ．直接染色法
（ 1 ）将固定好的玻片置于湿盘中，滴加荧光抗体染色液，以覆盖为度，加盖， 37 ℃感做 30 min ～ 45min 。
（ 2 ） PBS 冲洗 3 次，每次冲洗 3min ，即 3 × 3 ˊ 冲洗。
（ 3 ）蒸馏水冲洗。
（ 4 ）滴甘油缓冲液一滴，封片，荧光显微镜检查。
2． 间接染色法
（1） 检查抗原：①取固定标本，加已知的免疫血清， 37 ℃ 孵育 30min ；②以 PBS 液 3 × 3 ˊ 冲洗；③再加荧光标记的抗抗体， 37 ℃ 孵育 30min ；④ PBS 3 × 3 ˊ冲洗；⑤ H2 O 冲洗，凉干；⑥加甘油缓冲液，封片、镜检。
（2） 检查抗体：①以免疫后动物的淋巴组织涂片，自然干燥，甲醇固定；②滴加相应抗原液（按 1 ﹕ 100 ～ 1 ﹕ 500 稀释）， 37 ℃ 孵育 30min ；③ PBS 液 3 × 3 ˊ冲洗；④ 加荧光抗体， 37 ℃ 孵育 30min ；⑤ PBS 液 3 × 3 ˊ冲洗；⑥ 水洗，凉干；⑦加甘油缓冲液，封片、镜检。
（五）结果显示
荧光显微镜所观察到的图象，主要以两个指标判断结果，一个是形态学特征；另一个是荧光的亮度，在结果的判定中，必须将二者结合起来，综合判定。
荧光强度的表示方法如下：
＋＋＋ ～ ＋＋＋＋：荧光闪亮，呈明显的亮绿色。
＋＋ ：荧光明亮，呈黄绿色。
＋ ：荧光较弱，但清楚可见。
± ：极弱的可疑荧光。
－ ：无荧光。
（六）标本保存
由于荧光色素和蛋白质分子的稳定性都是相对的，因此随着保存时间的延长，在各种条件影响下，标记蛋白可能变性解离，失去其应有的亮度和特异性。因此给标本的保存带来一定的困难，所以在标本进行荧光染色之后应立即观察。
保存的方法可采取以下几种：①固定标本片以后低温保存，随用随染；②染色片采取优质封固剂，如特别的荧光封固剂（ Fluormount ）或碱性优质纯甘油固剂等封固。这些封固剂能防止荧光激发，封固后低温保存；④可以采用拍照保存照片。
