犬冠状病毒酶联免疫分析（ELISA）

犬冠状病毒 酶联免疫分析（ELISA ）

试剂盒使用说明书

本试剂仅供研究使用         目的：本试剂盒用于测定犬血清，血浆及相关液体样本中冠状病毒水平 。

实验原理：

  本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫法（ ELISA ）测定标本中 犬冠状病毒 。用纯化的 犬 冠状病毒 抗体 包被微孔板，制成固相抗体，可与样品中冠状病毒 相结合 ，经洗涤除去未结合的抗体和其他成分后 再与 HRP 标记的冠状病毒抗体 结合，形成抗体 - 抗原 - 酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物 TMB 显色。 TMB 在 HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度（ OD 值），与 CUTOFF 值相比较，从而判定标本中 犬 冠状病毒 的存在与否。

 

试剂盒组成 ：

试剂盒组成	48 孔配置	96 孔配置	保存
说明书	1 份	1 份
封板膜	2 片（ 48 ）	2 片（ 96 ）
密封袋	1 个	1 个
酶标包被板	1 × 48	1 × 96	2-8 ℃保存
阴性对照	0.5ml × 1 瓶	0.5ml × 1 瓶	2-8 ℃保存
阳性对照	0.5ml × 1 瓶	0.5ml × 1 瓶	2-8 ℃保存
酶标试剂	3 ml × 1 瓶	6 ml × 1 瓶	2-8 ℃保存
样品稀释液	3 ml × 1 瓶	6 ml × 1 瓶	2-8 ℃保存
显色剂 A 液	3 ml × 1 瓶	6 ml × 1 瓶	2-8 ℃保存
显色剂 B 液	3 ml × 1 瓶	6 ml × 1 瓶	2-8 ℃保存
终止液	3ml × 1 瓶	6ml × 1 瓶	2-8 ℃保存
浓缩洗涤液	（ 20ml × 20 倍）× 1 瓶	（ 20ml × 30 倍）× 1 瓶	2-8 ℃保存

 

样本处理及要求 ：

1. 血清：室温血液自然凝固 10-20 分钟，离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 / 分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2. 血浆：应根据标本的要求选择 EDTA 或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合 10-20 分钟后，离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 / 分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3. 尿液：用无菌管收集，离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 / 分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 / 分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用 PBS （ PH7.2-7.4 ）稀释细胞悬液，细胞浓度达到 100 万 /ml 左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 / 分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的 PBS ， PH7.4 。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持 2-8 ℃的温度。加入一定量的 PBS （ PH7.4 ），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 / 分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。

6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可 将标本放于 -20 ℃保存，但 应避免反复冻融 .

7. 不能检测含NaN3的样品 ，因 NaN3 抑制辣根过氧化物酶的（ HRP ）活性。

 

操作步骤：

1.         编号：将样品对应微孔按序编号，每板应设阴性对照 2 孔、 阳性对照 2 孔、空白对照 1 孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）

2.         加样：分别在阴、阳性对照孔中加入阴性对照、阳性对照 50μl 。然后在 待测样品孔先加样品稀释液 40 μl ，然后再加待测样品 10 μl 。 加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，

3.         温育：用封板膜封板后置 37 ℃温育3 0 分钟。   

4.         配液：将 30 （ 48T 的 20 倍）倍浓缩洗涤液加蒸馏水至 600ml 后备用

5.         洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后弃去，如此重复 5 次，拍干。

6.         加酶：每孔加入酶标试剂 50μl ，空白孔除外。

7.         温育：操作同 3 。

8.         洗涤：操作同 5 。

9.         显色：每孔先加入显色剂 A 50μl ，再加入显色剂 B 50μl ，轻轻震荡混匀， 37 ℃避光显色15 分钟

10.     终止：每孔加终止液 50μl ，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

11.     测定：以空白空调零， 450nm 波长依序测量各孔的吸光度（ OD 值）。 测定应在加终止液后 15 分钟以内进行。

 

结果判定：

    试验有效性：阳性对照孔平均值 ≥1.00; 阴性对照平均值 ≤0.10

  临界值（ CUT OFF ）计算：临界值 = 阴性对照孔平均值 +0.15

  阴性判定：样品 OD 值 < 临界值（ CUT OFF ）者为 冠状病毒 阴性

  阳性判定：样品 OD 值 ≥ 临界值（ CUT OFF ）者为 冠状病毒 阳性

注意事项

1 ．操作严格按照说明书进行，本试剂不同批号组分不得混用。

2 ．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡 15-30 分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。

3 ．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。

4．  封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

5 ．底物请避光保存。

6 ．试验结果判定必须以酶标仪读数为准，使用双波长检测时，参考波长为 630nm

7 ．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。终止液为 2M 的硫酸，使用时必须注意安全。

 

保存条件及有效期

1 ．试剂盒保存： ； 2-8 ℃ 。

2 ．有效期： 6 个月

-------------------------------------------------------------------------------------------

Shanghai Yueyan Biological Technology Co.,Ltd

Address:Room1104,No.9Building,Ning Guo Road No313,YangPu District,Shanghai,China.

Tel:+86-021-55785280 55785281

Fax:+86-021-55785279

E-mail:biolzy@yahoo.cn

-------------------------------------------------------------------------------------------