酶免疫分析

酶免疫分析

酶免疫分析，如 E L IS A ，是免疫分析的主要部分。理解了 E L IS A 的实验原理，就可以 理 解 其 他 以 抗 原 -抗 体 反 应 为 基 础 的 实 验 原 理 。依 据 其 实 验 操 作 程 序 ，我们知道E U S A 方法能检测任何给定抗体的特异性、亲和 性 、浓度及灵敏性。下面是进行直接或间 接 E L IS A 的操作步骤。直接与间接 E L IS A 的操作步骤基本是相同的。不同之处是与目标配体相结合的一抗是否是酶标抗体。在直接分析中，一抗是酶标抗体；在间接分析中 ，一抗不是酶标抗体，酶标记在识别一抗的二抗上。

一、试剂和材料

稀 释 液 ： 150mmol/L P B S ， p H 7. 6

包被缓冲液： 200mmol/L 碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液，pH 9. 5

洗漆缓冲液： 150mmol/L PBS 加 0. 0 5 % T w e e n

封闭缓冲液： 150mmol/L P B S 加 1 % 脱脂奶粉

一抗，交联或不交联酶，如 H R P 、碱性磷酸酶或者生物素

二抗，与一种酶，如 H R P 、碱性磷酸酶交联或者与生物素相交联

T M B (酶底物）

终 止 液 ： 0. 6mol/L HCl

二、操作步骤

(1) 在进行分析前，应首先建立酶标板每孔的加样策略。永远要设立空白孔作为阴性对照。例如，如果打算对血清或者培养上清进行抗体浓度滴定，我们常常是仅在奇数孔包被抗原，而如果是进行杂交瘤的阳性筛选，除了一个或者两个孔留作空白对照外，我们将整块板包被抗原。

(2) 进行分析前最好过夜包被酶标板。这 样 ，目标配体便有足够的时间与孔结合。孔板的包被可以放置在4℃，最长时间可达 2 周 。用包被缓冲液稀释配体至2〜5|ixg/m l。每个孔用 0. 1ml 的稀释配体进行包被。

(3) 进行分析时，从冰箱里拿出包被板。倒掉孔中的液体，用洗涤缓冲液洗整块孔板3 次 。每次洗涤后要在滤纸上扣干残留液体。

(4) 向所有孔中加 300ju l的封闭缓冲液。将孔板于室温静置至少30 m in ，然后用洗漆缓冲液洗孔板一次。

(5) 在封闭孔板的同时，用 PBS 稀释一抗。如果是筛选抗血清，我们通常进行 5 倍的倍比稀释，起 始 点 为 1 : 50 或 1 : 100。如要检测培养上清，进 行 2 倍的倍比稀释可能是适当的。如果是检测杂交瘤培养上清，不要做任何的稀释。

(6) 如果一抗是酶标抗体，可将其进行 1 : 1 00〜1 : 10 000稀释。可对几个稀释度的抗体进行测定。

(7) 向孔中加人 100W 稀释的抗体。对于系列稀释的抗体，最好每个稀释度加双份孔（一 共 4 个孔）。 37℃孵育孔板 30m in。

(8) 孵育后，用洗涤缓冲液洗板 3 次。每次洗涤后要在滤纸上扣干残留液体。

(9) 如果向孔板加入的是酶标一抗，越过此步而直接进行步骤 10。 间接分析中，向所有的孔中加人 100/zl稀释的酶标二抗。 30℃ 孵育孔板 30 min。

(10) 用洗涤缓冲液洗孔板 5 次 。每次洗涤后要在滤纸上扣干残留液体。

(11) 向所有的孔中加入100/x l的 T M B 底物。观察颜色的变化。让颜色反应到阴性对照显示轻微的颜色。这种现象未必会发生。如果不发生，5〜10 m in 后终止反应。

(12) 用 50//1 的终止液终止反应。

(13) 在酶标仪上以适当的吸光波长读取孔板颜色强度的数值。 T M B 底物自身的背景读数为 450nmol/L 。数值越大，抗体越多。

图 7. 9 显示的是一个滴定结果读数的直方图 。 一 个纯化的单克隆抗体被稀释后加人
到 用 其 特 异 性 配 体 包 被 的 板 中 。图 7. 9 中 可 以 看 出 ，即 使 在 单 克 隆 抗 体 被 稀 释 到6.25ng/ml 时 ，其特异的活性仍能被检测到。