测定蛋白质与DNA结合位点的电泳迁移率变动分析法
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放射性标记 DNA 探针的制备
l 聚丙烯酰胺凝胶的制备
1． 按照（三）中操作流程灌制非变性聚丙烯酰胺凝胶。将 10 × TBE 稀释成 0.5 ×的工作浓度。聚丙烯酰胺的工作浓度取决于待测 DNA 片段的大小， 200bp 左右的片段需要 4 ～ 5 ％的凝胶，小于 100bp 的片段应灌制 6 ～ 8 ％的凝胶。
l DNA 的标记
1． 用两种限制性内切酶从 10 μ g 质粒上将待测 DNA 片段切下。注意务必使至少一种酶酶切后产生 5’ 凸出末端。酶切体系终体积 50 μ l ，在适宜的酶反应缓冲液条件下反应 1 小时。
2． 向酶切反应混合液中加入
[ α－ 32 P]dATP （约 10 μ Ci/ μ l ） ( 若 5’ 凸末端含 T 残基 ) 10 μ l
dCTP(2mmol/L) 1 μ l
dGTP(2mmol/L) 1 μ l
dTTP(2mmol/L) 1 μ l
DNA 聚合酶（ Klenow 片段）（ 5 单位 / μ l ） 1 μ l
室温温育反应体系 30 分钟。
3． 加入 7 μ l 10 ×上样缓冲液终止反应。
l 标记探针的分离
1． 将反应混合物上样于非变性凝胶。
2． 10 ～ 15V/cm 条件下，用 0.5 × TBE 缓冲液电泳 2 ～ 3 小时。
3． 将玻璃板从电泳槽中取出，分开，并使凝胶粘附于其中任一块板上。用保鲜膜将凝胶覆盖起来。
4． 将凝胶室温下对 X 光片曝光 1 分钟。小心操作使得显像后的 X 光片与凝胶能以曝光时方位复原。
5． 用保鲜膜覆盖在放射性自显影照片上。再将带凝胶的玻璃板放在其上，以照片为模板，用刀片切下含标记 DNA 片段的凝胶片。将该凝胶片切成小片（约 1mm2 ）后，放入微量离心管中。
6． 向管中加入 1ml 洗脱缓冲液， 37 ℃连续振荡，温育过夜。
7． 将洗脱液转入两个干净微量离心管中（每管 500 μ l ），然后各加入 1ml 100 ％乙醇，－ 80 ℃放置 10 分钟。室温离心 15 分钟沉淀 DNA 。
8． 弃上清，用 80 ％乙醇洗沉淀，室温离心 5 分钟，用长颈巴斯德吸管移去上清，再用真空离心蒸发浓缩器或干燥器干燥沉淀。
9． 用闪烁计数器测定样品中的契仑科夫辐射量。将沉淀溶于适量 TE 中使标记探针的浓度为约 104 cpm/ μ l 。
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蛋白质与 DNA 结合反应
l 聚丙烯酰胺凝胶的制备
1． 按（三）中步骤灌制一块 5 ％非变性聚丙烯酰胺凝胶，用 10 × TGE 缓冲液配制成终浓度为 1 × TGE 的凝胶。
l 结合反应
1． 按下表中试验设计加样建立结合反应。向各个反应体系中加入蛋白提取物启始反应，温和吹吸或轻叩管底混匀反应物。
|
管号 |
DNA 探针 （μ l ） |
poly(dI-dC) • poly(dI-dC) （μ l ） |
10 × BB （μ l ） |
H2 O （μ l ） |
蛋白抽提液 （μ l ） |
|
1 |
1 |
2 |
3 |
24 |
0 |
|
2 |
1 |
2 |
3 |
23 |
1 |
|
3 |
1 |
2 |
3 |
21 |
3 |
|
4 |
1 |
2 |
3 |
19 |
5 |
|
5 |
1 |
2 |
3 |
14 |
10 |
|
6 |
1 |
0 |
3 |
22 |
4 |
|
7 |
1 |
0.5 |
3 |
21.5 |
4 |
|
8 |
1 |
1 |
3 |
21 |
4 |
|
9 |
1 |
3 |
3 |
19 |
4 |
|
10 |
1 |
3 |
3 |
17 |
4 |
2． 室温温育结合反应体系 30 分钟。
3． 向每个样品中加入 3 μ l 上样缓冲液后混匀，上样于 5 ％非变性聚丙烯酰胺凝胶。
4． 在 5 ～ 10V/cm 电压下， 1 × TGE 缓冲液中电泳 3 ～ 4 小时。电压大小取决于使用的 DNA 片段的长度。通常用 7V/cm 。
5． 从电泳装置上卸下玻璃，去掉垫片，分开玻璃板，使凝胶粘附于其中一块玻璃板上。将一张干燥的 Whatman 3MM 滤纸覆盖在凝胶上，小心剥下滤纸以使凝胶粘附于纸上。用保鲜膜覆盖凝胶，再用凝胶干燥器 80 ℃干燥凝胶 1 小时。
6． 将干燥凝胶对 X 光片在－ 80 ℃曝光过夜。
7． 分析数据。
非变性聚丙烯酰胺
1． 组装凝胶灌制装置，包括两块玻璃板（ 19.5cm × 19.5cm 和 19.5cm × 17cm ）及插于三个侧面的垫片（ 1.5mm 厚）。
2． 按下表混合下列成分配制成 5 ％非变性丙稀酰胺凝胶溶液：
丙稀酰胺（ 38 ％） / 双丙稀酰胺（ 2 ％）贮液 6.25ml
TGE （ 10 ×） 5ml
APS （ 10 ％） 500 μ l
用水定容至 50ml ，加入 50 μ l TEMED ，充分混匀，将溶液灌入凝胶灌制装置，插好梳子。
3． 凝胶聚合（约 30 分钟）后，移去梳子和底部垫片，将玻璃板装入电泳槽，在上下贮液槽中装满 1 × TGE 。冲净加样孔，除去可能存在于加样孔内和 / 或凝胶下的气泡。
4． 室温下保存凝胶直至上样，应当天使用凝胶。
