基因组文库法

四） 测效价和制备文库平板

1． 取 500ml 消毒培养瓶，注入 100ml 消毒 LB 培养液，再接种入 2ml 含有新鲜 LE392 细菌的麦芽糖液，培养至 OD₆₀₀ 近 1.0 。
2． 收集细胞分别于两个带螺旋帽 50ml 聚苯乙烯管中； 2500g 离心 10 分钟。
3． 弃上清，把每一沉淀物重悬入 25ml 消毒的 10mM MgSO₄ 中。
4． LE392 细胞在 4 ℃中可存两周；贮存过长会降低接种存活率。
5． 接种噬菌体和测效价：从每 250 μ l 包装反应液中取 1 μ l （从前（三）中 5 ），加入到 99 μ l TMG 中，分 1 μ l  和 10 μ l 此稀释液加入 13mm （直径）× 100mm （长）消毒管中；同时也稀释和铺制克隆载体平板、连接和包装，但无插入（三种 A 管），作为本底对照。
6． 从 4 步骤向每管中加 200 μ l LE392 细菌，混匀，室温孵育 20 分钟。
7． 加 2.5ml 含有 10 mM MgSO₄ 的上层琼脂（ 48 ℃）；在室温中把每管立即倒入琼脂平板上，旋动，令上层琼质分散均匀。
8． 室温中置 5 分钟，令琼脂变硬，反置平板， 37 ℃中培养 8~16 小时，当 LE392 细胞长满后，由于溶菌作用，空斑形成将非常明显。
9． 计算每一包装反应效价，统计每一平板空斑数，理想浓度的插入片段的效价应是：如建立文库成功，与无插入对照文库相比，至少大 5~10 倍。
10．         放大：如需放大，应用足够反应样品去建库，在最适条件下重复连接和包装反应，但不扩大反应规模；对哺乳动物基因组，理想的目标文库大小是 1~2 × 10⁶ 噬菌斑，合并包装混合物，并通过倒平板计算噬菌斑数，用来测定其效价，或文库的含量。
11．         以下 7 个步骤是倒平板供文库筛选，如果筛选前要扩增文库，则可按六、文库扩增 法进行，然后再回到步骤 12 。
12．         文库倒平板筛选：要筛选 5 × 10⁵ ~10⁶ 噬菌斑，一般每个 90mm LB 琼脂平板上有 10⁴ 噬菌体；先取 20ml LE392 细胞；装入 50ml 无菌带帽塑料试管中，在细菌中加入已知效价的包装混合液 5 × 10⁵ ~10⁶ 噬菌斑，混合。
13．         室温中置 20 分钟，令噬菌体附到细胞上。
14．         在 50~100 个 13 × 100mm 的无菌玻璃试管中各加 200 μ l 受吸附的细菌。
15．         室温下每管各加 2.5ml 48 ℃融化的无菌 LB 上层琼脂糖，并立即倒在 LB 琼脂平板上，摇动使之分布均匀，连续倒完全部平板。
16．         室温下置 15 分钟，使上层琼脂糖凝固，于 37 ℃倒置培养 8~16 小时。
17．         此间将出现噬菌斑。
18．         4 ℃保存平板。
 

五） 用放射性探针筛选已倒平板的文库

1. 将琼脂平板翻转，令琼脂面下，去掉培养皿盖，在室温中空气干燥 30 分钟。
1． 给每个培养皿编号，用笔在对应的 NC 滤膜上编号。
2． 把滤膜小心地铺在琼脂平板上，编号朝上，滤膜 0.5~1 分钟内变湿，持续 20 分钟使噬菌斑吸附到 NC 滤膜上。
3． 用一根干净的 18 号针头穿过滤膜和琼脂糖，戳 5~10 个孔，使滤膜在琼脂糖膜上定位（此步很重要）。
4． 用扁钳小心缓慢从平板上揭下滤膜，注意不要掀起含噬菌体的琼脂糖层，用记号笔在培养皿底部标记针孔。
5． 令号码面朝下，在室温中置 30 分钟让滤膜干燥，每个平板可再影印第 2 张滤膜，此对消除假阳性信号很有用，因所有的真阳性应在两张膜的同一位置上杂交，另外，第二张滤膜也可用第二种探针杂交。
6． 将滤膜相继浸入 100ml 下列 3 种溶液中（ 30~60 秒 / 每次）：
a.     0.2M NaOH ， 1.5M NaCl
b.     2 × SSC ， 0.4M Tris pH7.4
c.     2 × SSC
每浸润 25 张滤膜后更换一次溶液
7． 硝酸纤维素膜面朝上，放置在 Whatman 3mm 纸上，室温种干燥 1 小时。
8． 80 ℃真空干燥 2 小时。
9．     用杂交缓冲液湿润所有滤膜，切口平移的探针用缓冲液 -N ，合成探针用缓冲液 -S 。
10．  在 1 只 1L 烧杯中，放入滤膜和足够量的杂交缓冲液，浸泡滤膜。
11．  准备杂交探针：将比活性为 10⁸ cmp/ μ g 的切口平移探针 0.25 μ g 加到 1 个带螺纹帽的 50ml 试管中，加 0.5ml 2mg/ml 的鲑鱼精子 DNA 溶液，再依次加入下列溶液并振荡混合使其变形： 10M NaOH 50 μ l; 2M Tris pH7.4 300 μ l; 1M HCl （延壁加） 500 μ l 。
12．  将此变性的探针加到放有滤膜和缓冲液的烧杯中，旋转均匀。
13．  于 42 ℃振荡（轻轻摇动） 4~16 小时，使切口平移探针杂交（合成探针的保温温度不同）。
14．  倒出烧杯中的杂交缓冲液，用 500ml 含 0.1%SDS(W/V)2 × SSC 溶液在室温中摇动 15 分钟。
15．  按步骤 15 再洗两次，低盐洗涤前用吸水纸吸干所有滤膜。
16．  用含 0.1%SDS(W/V)0.1 × SSC 500ml ， 52 ℃洗涤滤膜两次，每次 15 分钟。
17．  倒去洗涤缓冲液，用 Whatman 3mm 滤纸吸干滤膜，在空气中干燥 1 小时。
18．  将 NC 滤膜贴在 3mm 滤纸上，用放射性墨水标记 3mm 滤值；滤膜用干净塑料纸包好，用增强屏在 XAR-5 底片下于 -70 ℃曝光过夜，检测阳性信号。
 

第二次筛选
19．  将 200 μ l LE392 指示菌加到 13 × 100mm 试管中。加 2.5ml 含 10mM MgSO₄ 的 48 ℃ LB 上层琼脂，室温下立即倒入 90mm 的 LB 琼脂板上，静止 5 分钟使之凝固，形成细菌苔，在培养皿底划 50 个格子，供第二次噬菌体的生长。
20．  按照膜上放射性墨水标记与 X 光底片对齐，用标记笔将膜上的位置孔标记在底片上，用透射光帮助对齐。
21．  根据放射自显影信号，用牙签挑取阳性噬菌体斑或其附近噬菌体。
22．  将牙签上噬菌体斑，点在各个菌苔方格里，只要将牙签尖在菌苔上轻轻触一下即可。
23．  倒置平板， 37 ℃培养过夜。
24．  加盖 NC 滤膜，筛选，按步骤 1-19 进行。
 

第三次筛选
25．  用牙签转移来自每一个原始阳性信号的第二轮单个杂交噬菌斑中的噬菌体，每个牙签可转移 10⁶ ~10⁷ 个噬菌体颗粒。
26．  将牙签放进盛有 10ml 无菌 TMG 缓冲液的无菌管中，剧烈振荡混合，以混匀噬菌体。
27．  将步骤 27 的 TMG 混合液 0.25 μ l 和 2.5 μ l 放入两个含有 200 μ l LE 392 倒平板细胞的 13 × 100mm 管子内，加 2.5ml 48 ℃含 10mM MgSO₄ 的 LB 上层琼脂，室温下立即倒在 90mm 的 LB 琼脂板上，摇动使之分布均匀，室温下凝固 15 分钟。
28．  倒置平板， 37 ℃培养过夜，每个平板应形成 50~500 个噬菌斑。
29．  用干净牙签从 100~200 个单独分开的噬菌斑中，把噬菌体转移到长有 LE392 菌苔的平板上。
30．  倒置平板， 37 ℃培养过夜。
31．  按步骤 1-19 对格子里的噬菌体作第三次杂交和筛选。阳性信号为纯化的噬菌斑克隆，每一个来自初始阳性信号的“战胜者”，按步骤 26 用牙签转移到 5ml TMG 液。
32．  加 1 μ l TMG 混合液到 200 μ l LE392 到平板细胞中，按步骤 28 和 29 进行， 37 ℃倒置培养过夜。
33．  此平板上所有的噬菌斑，都是该克隆的纯化噬菌斑，这平板可用 Parafilm 封柱，贮于 4 ℃中，作为克隆的原种。平板上的单个噬菌斑，可直接用于这种噬菌体生长的制备。
 

六）文库扩增

1． 每 2 × 10⁴ 文库中的噬菌体在一个无菌的 13 × 100mm 试管中同 200 μ l LE392 细胞混合。一般说，扩增 2 × 10⁶ 个噬菌斑的文库需 100 个试管，室温下吸附培养 20 分钟。
2． 在每个试管中加入含 10mM MgSO₄ 48 ℃的软琼脂 2.5ml 室温下立即倒在 90mm 的 LB 琼脂板上，摇动铺匀，不要倒转平板，否则琼脂会滑到一边， 37 ℃培养 6~10 小时。
3． 当噬菌体开始形成针尖状噬菌体斑，而尚未变大连接成片时，加 2ml LB 培养液，用无菌塑料棒或弯曲的移液玻璃管从平板上刮下软琼脂，装入一个无菌的 1L 烧杯中，每 100ml 体积平板上刮下的软琼脂中加 2ml 氯仿。
4． 在一末端为圆锥形的无菌离心管中， 3000g 离心混合物 10 分钟，琼脂和细菌碎片将在管底形成沉淀，轻轻倒出含有扩增文库的上清液。
5． 测定文库体积：加 NaCl 晶体至种浓度为 1M 。
6． 稀释和倒平板，以测定扩增文库效价，标准的效价为每 1ml 5 × 10⁹ ~10¹⁰ 个噬菌体。
7． 将文库分装在 1ml 无菌管中，每管加 3 滴氯仿， 4 ℃贮存。
8． 在倒平板和筛选前再测定文库效价。

四） 测效价和制备文库平板

1． 取 500ml 消毒培养瓶，注入 100ml 消毒 LB 培养液，再接种入 2ml 含有新鲜 LE392 细菌的麦芽糖液，培养至 OD₆₀₀ 近 1.0 。
2． 收集细胞分别于两个带螺旋帽 50ml 聚苯乙烯管中； 2500g 离心 10 分钟。
3． 弃上清，把每一沉淀物重悬入 25ml 消毒的 10mM MgSO₄ 中。
4． LE392 细胞在 4 ℃中可存两周；贮存过长会降低接种存活率。
5． 接种噬菌体和测效价：从每 250 μ l 包装反应液中取 1 μ l （从前（三）中 5 ），加入到 99 μ l TMG 中，分 1 μ l  和 10 μ l 此稀释液加入 13mm （直径）× 100mm （长）消毒管中；同时也稀释和铺制克隆载体平板、连接和包装，但无插入（三种 A 管），作为本底对照。
6． 从 4 步骤向每管中加 200 μ l LE392 细菌，混匀，室温孵育 20 分钟。
7． 加 2.5ml 含有 10 mM MgSO₄ 的上层琼脂（ 48 ℃）；在室温中把每管立即倒入琼脂平板上，旋动，令上层琼质分散均匀。
8． 室温中置 5 分钟，令琼脂变硬，反置平板， 37 ℃中培养 8~16 小时，当 LE392 细胞长满后，由于溶菌作用，空斑形成将非常明显。
9． 计算每一包装反应效价，统计每一平板空斑数，理想浓度的插入片段的效价应是：如建立文库成功，与无插入对照文库相比，至少大 5~10 倍。
10．         放大：如需放大，应用足够反应样品去建库，在最适条件下重复连接和包装反应，但不扩大反应规模；对哺乳动物基因组，理想的目标文库大小是 1~2 × 10⁶ 噬菌斑，合并包装混合物，并通过倒平板计算噬菌斑数，用来测定其效价，或文库的含量。
11．         以下 7 个步骤是倒平板供文库筛选，如果筛选前要扩增文库，则可按六、文库扩增 法进行，然后再回到步骤 12 。
12．         文库倒平板筛选：要筛选 5 × 10⁵ ~10⁶ 噬菌斑，一般每个 90mm LB 琼脂平板上有 10⁴ 噬菌体；先取 20ml LE392 细胞；装入 50ml 无菌带帽塑料试管中，在细菌中加入已知效价的包装混合液 5 × 10⁵ ~10⁶ 噬菌斑，混合。
13．         室温中置 20 分钟，令噬菌体附到细胞上。
14．         在 50~100 个 13 × 100mm 的无菌玻璃试管中各加 200 μ l 受吸附的细菌。
15．         室温下每管各加 2.5ml 48 ℃融化的无菌 LB 上层琼脂糖，并立即倒在 LB 琼脂平板上，摇动使之分布均匀，连续倒完全部平板。
16．         室温下置 15 分钟，使上层琼脂糖凝固，于 37 ℃倒置培养 8~16 小时。
17．         此间将出现噬菌斑。
18．         4 ℃保存平板。
 

五） 用放射性探针筛选已倒平板的文库

1. 将琼脂平板翻转，令琼脂面下，去掉培养皿盖，在室温中空气干燥 30 分钟。
1． 给每个培养皿编号，用笔在对应的 NC 滤膜上编号。
2． 把滤膜小心地铺在琼脂平板上，编号朝上，滤膜 0.5~1 分钟内变湿，持续 20 分钟使噬菌斑吸附到 NC 滤膜上。
3． 用一根干净的 18 号针头穿过滤膜和琼脂糖，戳 5~10 个孔，使滤膜在琼脂糖膜上定位（此步很重要）。
4． 用扁钳小心缓慢从平板上揭下滤膜，注意不要掀起含噬菌体的琼脂糖层，用记号笔在培养皿底部标记针孔。
5． 令号码面朝下，在室温中置 30 分钟让滤膜干燥，每个平板可再影印第 2 张滤膜，此对消除假阳性信号很有用，因所有的真阳性应在两张膜的同一位置上杂交，另外，第二张滤膜也可用第二种探针杂交。
6． 将滤膜相继浸入 100ml 下列 3 种溶液中（ 30~60 秒 / 每次）：
a.     0.2M NaOH ， 1.5M NaCl
b.     2 × SSC ， 0.4M Tris pH7.4
c.     2 × SSC
每浸润 25 张滤膜后更换一次溶液
7． 硝酸纤维素膜面朝上，放置在 Whatman 3mm 纸上，室温种干燥 1 小时。
8． 80 ℃真空干燥 2 小时。
9．     用杂交缓冲液湿润所有滤膜，切口平移的探针用缓冲液 -N ，合成探针用缓冲液 -S 。
10．  在 1 只 1L 烧杯中，放入滤膜和足够量的杂交缓冲液，浸泡滤膜。
11．  准备杂交探针：将比活性为 10⁸ cmp/ μ g 的切口平移探针 0.25 μ g 加到 1 个带螺纹帽的 50ml 试管中，加 0.5ml 2mg/ml 的鲑鱼精子 DNA 溶液，再依次加入下列溶液并振荡混合使其变形： 10M NaOH 50 μ l; 2M Tris pH7.4 300 μ l; 1M HCl （延壁加） 500 μ l 。
12．  将此变性的探针加到放有滤膜和缓冲液的烧杯中，旋转均匀。
13．  于 42 ℃振荡（轻轻摇动） 4~16 小时，使切口平移探针杂交（合成探针的保温温度不同）。
14．  倒出烧杯中的杂交缓冲液，用 500ml 含 0.1%SDS(W/V)2 × SSC 溶液在室温中摇动 15 分钟。
15．  按步骤 15 再洗两次，低盐洗涤前用吸水纸吸干所有滤膜。
16．  用含 0.1%SDS(W/V)0.1 × SSC 500ml ， 52 ℃洗涤滤膜两次，每次 15 分钟。
17．  倒去洗涤缓冲液，用 Whatman 3mm 滤纸吸干滤膜，在空气中干燥 1 小时。
18．  将 NC 滤膜贴在 3mm 滤纸上，用放射性墨水标记 3mm 滤值；滤膜用干净塑料纸包好，用增强屏在 XAR-5 底片下于 -70 ℃曝光过夜，检测阳性信号。
 

第二次筛选
19．  将 200 μ l LE392 指示菌加到 13 × 100mm 试管中。加 2.5ml 含 10mM MgSO₄ 的 48 ℃ LB 上层琼脂，室温下立即倒入 90mm 的 LB 琼脂板上，静止 5 分钟使之凝固，形成细菌苔，在培养皿底划 50 个格子，供第二次噬菌体的生长。
20．  按照膜上放射性墨水标记与 X 光底片对齐，用标记笔将膜上的位置孔标记在底片上，用透射光帮助对齐。
21．  根据放射自显影信号，用牙签挑取阳性噬菌体斑或其附近噬菌体。
22．  将牙签上噬菌体斑，点在各个菌苔方格里，只要将牙签尖在菌苔上轻轻触一下即可。
23．  倒置平板， 37 ℃培养过夜。
24．  加盖 NC 滤膜，筛选，按步骤 1-19 进行。
 

第三次筛选
25．  用牙签转移来自每一个原始阳性信号的第二轮单个杂交噬菌斑中的噬菌体，每个牙签可转移 10⁶ ~10⁷ 个噬菌体颗粒。
26．  将牙签放进盛有 10ml 无菌 TMG 缓冲液的无菌管中，剧烈振荡混合，以混匀噬菌体。
27．  将步骤 27 的 TMG 混合液 0.25 μ l 和 2.5 μ l 放入两个含有 200 μ l LE 392 倒平板细胞的 13 × 100mm 管子内，加 2.5ml 48 ℃含 10mM MgSO₄ 的 LB 上层琼脂，室温下立即倒在 90mm 的 LB 琼脂板上，摇动使之分布均匀，室温下凝固 15 分钟。
28．  倒置平板， 37 ℃培养过夜，每个平板应形成 50~500 个噬菌斑。
29．  用干净牙签从 100~200 个单独分开的噬菌斑中，把噬菌体转移到长有 LE392 菌苔的平板上。
30．  倒置平板， 37 ℃培养过夜。
31．  按步骤 1-19 对格子里的噬菌体作第三次杂交和筛选。阳性信号为纯化的噬菌斑克隆，每一个来自初始阳性信号的“战胜者”，按步骤 26 用牙签转移到 5ml TMG 液。
32．  加 1 μ l TMG 混合液到 200 μ l LE392 到平板细胞中，按步骤 28 和 29 进行， 37 ℃倒置培养过夜。
33．  此平板上所有的噬菌斑，都是该克隆的纯化噬菌斑，这平板可用 Parafilm 封柱，贮于 4 ℃中，作为克隆的原种。平板上的单个噬菌斑，可直接用于这种噬菌体生长的制备。
 

六）文库扩增

1． 每 2 × 10⁴ 文库中的噬菌体在一个无菌的 13 × 100mm 试管中同 200 μ l LE392 细胞混合。一般说，扩增 2 × 10⁶ 个噬菌斑的文库需 100 个试管，室温下吸附培养 20 分钟。
2． 在每个试管中加入含 10mM MgSO₄ 48 ℃的软琼脂 2.5ml 室温下立即倒在 90mm 的 LB 琼脂板上，摇动铺匀，不要倒转平板，否则琼脂会滑到一边， 37 ℃培养 6~10 小时。
3． 当噬菌体开始形成针尖状噬菌体斑，而尚未变大连接成片时，加 2ml LB 培养液，用无菌塑料棒或弯曲的移液玻璃管从平板上刮下软琼脂，装入一个无菌的 1L 烧杯中，每 100ml 体积平板上刮下的软琼脂中加 2ml 氯仿。
4． 在一末端为圆锥形的无菌离心管中， 3000g 离心混合物 10 分钟，琼脂和细菌碎片将在管底形成沉淀，轻轻倒出含有扩增文库的上清液。
5． 测定文库体积：加 NaCl 晶体至种浓度为 1M 。
6． 稀释和倒平板，以测定扩增文库效价，标准的效价为每 1ml 5 × 10⁹ ~10¹⁰ 个噬菌体。
7． 将文库分装在 1ml 无菌管中，每管加 3 滴氯仿， 4 ℃贮存。
8． 在倒平板和筛选前再测定文库效价。