瞬时转染真核基因表达调控技术

调节瞬时转染基因的表达

l 四环素作为哺乳动物细胞中可诱导基因表达的调控物

阶段一： pTet-tTAk 稳定转染成纤维细胞

培养和转染细胞

1. 在 DMEM 完全培养液中培养贴壁细胞。转染前一天，把细胞换到含有 0.5 μ g/ml 四环素 -HCl （四环素）的 DMEM 完全培养液中。每个 10 cm 培养皿中加入足量细胞，使转染那天，细胞可以有 33% 的汇合度。

2. 在合适的限制性内切酶位点使质粒线性化，并把每秒质粒的浓度调整为≥ 0.5 mg/ml 。 10 ～ 20 μ g 质粒 pTet-tTAk 和 1 ～ 2 μ g pSV2-His （ Tet 质粒与带选择标记的质粒的摩尔比大约为 10 ： 1 ）与 500 μ l HEPES 缓冲液在一个干净的 4 ml 聚丙乙烯管中混合。

3. DNA 混合物中加入 32.5 μ l 2 mol/L CaCl₂ 。立即轻轻振荡使溶液混匀。溶液在室温保存，不时地混匀。 15 ～ 30 min 后会形成絮状沉淀。

4. 吸掉步骤 1 准备的细胞培养皿中的所有培养液。

5. 用巴斯德吸管混合 CaCl₂ -DNA 若干次。滴加混合物，使它均匀地盖在单层细胞上。

6. 细胞在 37 ℃， 5% CO₂ 条件下培养 30 min ， 15 min 后摇动培养皿，保证 DNA 沉淀物的均匀覆盖。

7. 每个细胞培养皿中加入 10 ml 含有四环素的 DMEM 完全培养液。细胞在 37 ℃， 5% CO₂ 条件下培养 4 ～ 5 h 。

8. 轻轻吸掉培养液。避免破坏细胞上的沉淀物。

9. 加 2.5 ml 含 15% 甘油而且预热到 37 ℃的 HEPSE 缓冲液进行甘油休克。细胞在室温放置 2.5 min 。甘油是滴加到培养液中。

10. 恰好在 2.5 min 的时候吸掉甘油溶液。操作得快一点，因为甘油对细胞毒性很大。

11. 立即又轻又快地加入 10 ml 含有四环素地 DMEM 完全培养液洗细胞。立即吸掉培养液，再重复洗涤。

12. 细胞中加入 10 ml 含有四环素地 DMEM 完全培养液， 37 ℃培养过夜。

13. 转染后大约 16 ～ 24 h ，吸掉培养液，换上 10 ml 含有四环素的 DMEM 完全培养液。转染后一共在 37 ℃培养 48 h （即步骤 12 和 13 的总培养时间）。

转染细胞的筛选和克隆

14. 转染后 48 h ，细胞用几种稀释度分到含有 125 μ mol/L L- 组氨醇和 0.5 μ g/ml 四环素 -HCl 的培养液中。细胞密度为每个 10 cm 培养皿大约 1 × 10⁶ 到 3 × 10⁴ 。含有大约 1 × 10⁵ 细胞的培养皿需要培养若干个。

15. 细胞在选择培养液中培养 4 天后，接着用 3 ～ 4 ml 含有 125 μ mol/L L- 组氨醇和 0.5 μ g/ml 四环素 -HCl 的选择培养液培养。

16. 集落形成后（通常经过大约 10 ～ 12 天选择培养），换成含有 250 μ mol/L L- 组氨醇和 0.5 μ g/ml 四环素 -HCl 的选择培养液。

17. 集落长好以后（选择培养 12 ～ 15 天），在培养皿的底部用圆画出每个集落的边界。吸掉培养液，在培养皿的单个克隆上放置无菌的塑料克隆环。每个挑选的集落重复这个步骤。从培养皿挑选细胞，要求单个集落隔得比较开，而且易于分辨。

18. 用大约 100 μ l 磷酸缓冲液很快地洗克隆。为了使细胞脱落，加 2 滴 1 ×胰酶 -EDTA （ 100 μ l ）并放置 30 ～ 60s 。用巴斯德吸管上下吹打使细胞变松。每个集落转移到 24 孔组织培养液板的一个孔中，每个孔中有 1 ml 含 250 μ mol/L L- 组氨醇和四环素的选择培养液。

19. 当孔中的细胞长到 80% 汇合度，把它们转移到 6 cm 组织培养皿中，用含有 500 μ mol/L L- 组氨醇和四环素的选择培养液。

20. 细胞在含有 500 μ mol/L L- 组氨醇和四环素的选择培养液中扩大培养（通常细胞进行 1 ： 5 到 1 ： 10 稀释）。

细胞进行蛋白诱导表达测试

21. 当单层细胞再次生长到大约 80% 汇合度，每个细胞克隆收集一部分，在液氮中冻存。余下的细胞进行传代培养，直到数量足够用于测试蛋白的诱导表达。

22. 如果细胞用 tTA 和靶质粒共转染，可以如阶段 3 所述直接分析靶基因的产物。如果细胞只用 pTet-tTAk 质粒转染，如下进行细胞的诱导表达测试：

a. 诱导前一天，细胞以适当的密度在含有 500 μ mol/L L- 组氨醇和 0.5 μ g/ml 四环素 -HCl 的 DMEM 培养液培养，使它们在收获时可以达到亚汇合态。

b. 第二天，用 PBS 细胞洗细胞 3 次，每次都要轻轻旋转培养板。

c. 第三次洗涤后，立即加入含有 500 μ mol/L L- 组氨醇但不含四环素的选择培养液。细胞在含或不含四环素的培养液中培养 6 ～ 48 h 。

23. 通过 Northern 分析或免疫印迹法测试细胞中 tTA 的诱导表达。然后如阶段 2 所述，用靶质粒转表达 tTA 的细胞系。

阶段 2 ：四环素调控的靶基因稳定转染可诱导表达 tTA 的 NIH-3T3 细胞

培养和转染细胞

1. 在含有 500 μ mol/L L- 组氨醇和 0.5 μ g/ml 四环素 -HCl 完全选择培养液中培养可以诱导表达自身调控的 tTA 的稳定细胞系（阶段 1 中的分离得到）。转染前一天，把细胞传代到含有完全选择培养液的 10 cm 组织培养皿中。每个培养皿转入足量细胞，使转染那天单层细胞可以有 33% 的汇合度。

2. 在合适的限制性内切酶位点使质粒线性化，并把每种质粒的浓度调整为≥ 0.5mg/ml 。每种靶基因质粒 10 ～ 20 μ g 和 1 ～ 2 μ g pPGKPuro （每种四环素质粒与带选择标记的质粒摩尔比位 10 ： 1 ）与 500 μ l HEPES 缓冲液在一个干净的 4 ml 聚丙乙烯管中混合。

3. 进行阶段 1 中步骤 3-13 。

选择和克隆转染细胞

4. 转染后 48 h ，细胞用几种稀释度分到含有 500 μ mol/L L- 组氨醇、 3 μ g/ml 嘌呤霉素和 0.5 μ g/ml 四环素的选择培养液中。细胞密度为每个 10 cm 培养皿大约 1 × 10⁶ 到 3 × 10⁴ 。含有大约 1 × 10⁵ 细胞的培养皿需要培养若干个。

5. 细胞在选择培养液中培养 4 天后，接着用 3~4 ml 含有 500 μ mol/L L- 组氨醇、 3 μ g/ml 嘌呤霉素和 0.5 μ g/ml 四环素的选择培养液培养。

6. 集落长好以后（选择培养 12 ～ 14 天），在培养皿的底部用圆画出每个集落的边界。吸掉培养液，在培养皿的单个克隆上放置无菌的塑料克隆环。每个挑选的集落重复这个步骤。从培养皿中挑选细胞，要求单个集落隔得比较开，而且易于分辨。

7. 用大约 100 μ l 磷酸缓冲液很快地洗克隆。为了使细胞脱落，加 2 滴 1 ×胰酶 -EDTA （ ~100 μ l ）并放置 30 ～ 60 s 。用巴斯德吸管上下吹打使细胞变松。每个集落转移到 24 孔组织培养板的一个孔中，每个孔中有 1 ml 含有 500 μ mol/L L- 组氨醇、 3 μ g/ml 嘌呤霉素和 0.5 μ g/ml 四环素的选择培养液。

8. 当孔中的细胞长到 80% 汇合度，把它们转移到 6 cm 组织培养皿中，用含有 500 μ mol/L L- 组氨醇、 3 μ g/ml 嘌呤霉素和 0.5 μ g/ml 四环素的选择培养液培养。

9. 细胞在含有 500 μ mol/L L- 组氨醇、 3 μ g/ml 嘌呤霉素和 0.5 μ g/ml 四环素的选择培养液中扩大培养（通常细胞进行 1 ： 5 到 1 ： 10 稀释）。

10. 当单层细胞再次生长到大约 80% 汇合度，每个细胞克隆收集一部分，在液氮中冻存。余下的细胞进行传代培养，直到数量足够用于测试靶基因蛋白的诱导表达。测试方法在阶段 3 介绍。

阶段 3 ：分析转染细胞中的蛋白质表达

细胞的生长和诱导

1. 诱导前一天晚上，细胞以适当的密度在含有 500 μ mol/L L- 组氨醇、 3 μ g/ml 嘌呤霉素和 0.5 μ g/ml 四环素 -HCl 的 DMEM 培养液中培养，使它们在收获时可以达到亚汇合态。

2. 第二天，用 PBS 洗细胞 3 次，每次都要轻轻旋转培养液。

3. 第三天洗涤后，立即加入含有 500 μ mol/L L- 组氨醇、 3 μ g/ml 嘌呤霉素但不含四环素的选择培养液。细胞在含或不含四环素的培养液中培养 6 ～ 48 h 。

收获细胞

4. 细胞生长适当的时间后，快速收获并放到冰浴的管中。

5. 每个克隆和对照都转移 0.5 × 10⁶ 细胞到离心管中，然后所有管子在 4 ℃以 3000 r/min （低或中速）离心 5 min 。

6. 加 1 ml 冰冷的磷酸盐缓冲液洗细胞。如步骤 5 洗细胞，轻轻吸掉上清，不要扰动细胞沉淀。

7. 细胞沉淀放在冰浴上，在离心管架上放的孔中轻快地旋动管子使沉淀变松，然后把它冻存在 -70 ℃。

准备裂解物

8. 细胞沉淀用 30 μ l 蛋白样品缓冲液重悬，轻轻地吹打细胞，然后振荡管子。

9. 细胞在蛋白样品缓冲液中煮 10 min 。

10. 以最大速度离心 2 min 收集细胞碎片。

11. 在 Tris- 甘氨酸 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶的每个冰道加 10 μ l 细胞裂解物。

12. 用合适的时间跑胶。

13. 蛋白从 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电转移到 PVDF 膜上，用合适的抗体检测。