二聚体介导的体外基因表达调控

二聚体介导的体外基因表达调控

材料

试剂
二 聚 体（本 节 描 述 的 二 聚 体 的 化 学 结 构 如 图 3 所 示）

雷 帕 霉 素 类 似 物 A P 2 1 9 6 7 和 A P 23102 (A R I A D 公 司）

雷 帕 霉 素（Sigma-Aldrich 公 司 ， 目 录 号 R 〇 395)

通 常 此 化 合 物 为 干 粉 ，应 在 密 封 容 器 中 避 光 保 存 于 一 2 〇°C 。

N ，N-二 甲 基 乙 酰 胺 < ! > (D M A ; 如 Sigma-Aldrich 公司 D 5511)

小鼠

构 建 的 质 粒（见 方 案 1)

聚 乙 二 醇 4 0 0 (P E O 400 ; 如 J .T.Baker 公司 U 216-07)

聚 氧 乙 烯 山 梨 糖 醇 酐 单 月 桂 酸 酉 旨（T w e e n -8 0 ; 如 Sigma-Aldrich 公 司 P 1754)

仪器

玻 璃 瓶

旋 涡 混 合 器

方法

1 . 运 用 适 当 的 技 术 将 转 录 因 子 和 靶 基 因 载 体 导 入 实 验 动 物 体 内 。例 如 ，肌 肉 注 射 给 胃分 离 的 A A V 载 体（Rivera et al.1999， 2005)。

2• 准 备 将 腹（膜）腔 内 给 药 入 小 鼠 的 二 聚 体 药 物 。给 出 的 例 子 是 A P 21967。雷 帕 霉 素的 配 制 、储 存 及 给 药 是 相 同 的 。

a. 如 果 是 10m g / k g 的 剂 量 ，将 A P 2 1 9 6 7 溶 于 D M A 达 10m g / k g 浓 度 。旋 涡 振 荡 几分 钟 至 化 合 物 溶 解 。该 化 合 物 储 存 液 可 于 一 20°C 保 存 至 2 个 月 。

若给以低于 10 mg/k g 的剂量，可用更稀的溶于 D M A 的 AP21967 的储存液。在大多数应用中 ， AP2 1 % 7 是我们推荐的二聚体，因为它同雷帕霉素相比抗增殖活性是减弱的（图 3)。

b• 准 备 一 种 P E 0 4 0 0 和 T w e e n 8 0 比 率 为 9 : 1 的 储 存 液 。该储存液能事先准备，在常温下可保存至一个月。

c• 在 使 用 前 短 时 间 内 ，混 合 等 量 的 A P 21967/ D M A 和 P E G /T w e e n 使 溶 液 中
A P 2 1 9 6 7 剂 量 达 5m g /k g 。 旋 涡 振 荡 使 混 合 均 匀 。

3•将适量的 5m g /k g A P 21967 溶液以 2 mlZkg 的剂量腹（膜）腔内给药，如以 lOmg/kg的剂量人 20 g 的小鼠，腹（膜）腔内给药 4 0 ul。

此 种 配 方 只 适 用 于 腹（膜）腔内给药，由 于 D M A 对小鼠有毒性，我们建议在开始研究之前以手动方法凭经验注射（在非转导的动物上)。手动剂量动物应该一直作为对照之一。

4•确定剂量反应和表达的动力学。在起始实验中，测 量 A P 21967 在一个范围内的浓度(如 0• 3〜10 mg/kg) 找到最有效的浓度以便使用。

在目前为止的研究中， AP21967 腹（膜）腔内给药至 30 mg/k g 对动物没有毒性。起始研究应显示用单一剂量的二聚体所致的诱导作用和衰减动力学