Pichia酵母表达系统操作方法

我先说我有的质粒和菌株：PPIC9K，PPIC9，PPICZahphaA，B，C
以及一个改造的PPIC9K载体，EcoRI和BamHI双酶切，C末端引入了一个6histag
菌株：GS115，KM71，X33，以及十几个空载体对照菌株
我的酵母表达Protocol：
>10ug质粒用Sal线性化，加1/10体积的3M NaAC PH5.2和3倍体积的乙醇沉淀
70％乙醇洗一遍，20ul ddH2O重溶
按照公司手册做电转化感受态，一般OD600到1.1-1.3，0.2cm转化杯中电转化
每个样品涂5块左右10cm的MD板，一般有>1000个转化子
足够用不同浓度的G418板筛选，一般做0.5,1.0,2.0mg/ml梯度或干脆用1.0
然后每个样品从G418板上挑10个左右单克隆于2ml BMGY摇菌（30ml玻璃管，比LB管大一点），纱布一般用8层，一天左右看着比较浑
离心，留样1ml，余1ml换2ml BMMY诱导表达，3,4层纱布足够了
一般1－2天收集表达上清，稀释一定比例铺板做ELISA检测
一般都在蛋白的C末端加入了6个his，用抗histag抗体检测，4个小时出结果
和GS115空菌株做对照，根据阳性值高低判断蛋白表达量
挑选阳性值最高的克隆大量表达，纯化蛋白
从抽质粒做感受态开始，整个过程顺利的话两个星期内出结果
我一般连鉴定Mut+和Muts表型都省了，SalI线性化绝大部分都是Mut+表型
另外表达上清用TCA浓缩跑电泳鉴定也是一种方法，但是重复性不好
至于蛋白有没有表达就要看你的运气了，一般重复2－3次实验都没有表达菌株，这个蛋白就放弃表达了