Western杂交

Western 杂交

 

l      组织印迹的 Western 杂交

 

在硝酸纤维素膜上制备组织印迹

1． 在塑料板上放置两层 Whatman 1 号滤纸，在滤纸上方放上一张普通纸，然后铺上一层硝酸纤维素膜。

2． 用双面刀片从植物组织如大豆的茎上切取一块切片（厚度约为 1mm ）。如果组织表面是湿的，则在 Kimwipes 纸上轻轻吸干或用蒸馏水洗涤几秒钟然后再用 Kimwipes 纸吸干。用镊子将组织切片转移到硝酸纤维素膜上，注意一旦将切片放置在膜上以后就不得再移动切片。在切片上放置 4 层 Kimwipes 纸，用手指轻轻压 15 到 20 秒，用镊子小心拿开纸和组织切片。组织切片经甲苯酸蓝染色后观察其解剖结构。

3． 将留有组织印迹的硝酸纤维素膜在空气中晾干。

4． 将留有印迹的膜面向下，放入载玻片上的一滴甲苯酸蓝溶液中，对组织切片进行染色。 2 ～ 3 分钟后，吸干多余的染料，用间接照明立刻照相。将载玻片翻转，透过玻璃拍摄染色的组织切片。在切片上粘上几张纸片以免组织切片接触显微镜。

 

 

用特定的抗体检测组织印迹中的蛋白质（室温下）

1． 在浅碟子里倒入 30 ～ 40ml 洗涤缓冲液 I ，清洗留有印迹的硝酸纤维素 15 分钟。

洗涤缓冲液 I ：

0.1mol/L Tris-HCl(pH8.0)

0.05% 叠氮化钠

0.3 ％ Twen-20

2． 将膜转移到 15ml 印迹缓冲液中，培育 3 小时。

3． 把膜转入 10ml 用印迹缓冲液稀释的初级抗体溶液中，培育 2 小时。

4． 在 40ml 洗涤缓冲液 I 中清洗硝酸纤维素膜 10 分钟，换上新鲜缓冲液，重复清洗 3 次。

5． 将膜转入 10ml 用印迹缓冲液稀释的与碱性磷酸酶结合的二级抗体溶液中，培育 1 小时。

6． 在 40ml 洗涤液 I 中清洗硝酸纤维素膜 10 分钟。

7． 在 40ml 洗涤缓冲液Ⅱ中清洗硝酸纤维素膜 15 分钟，换上新鲜缓冲液，重复清洗 1 次。

洗涤缓冲液Ⅱ：

0.1 mol/L Tris-HCl(pH8.0)

0.05% 叠氮化钠

0.3% Tween-20

0.05% 十二烷基硫酸钠

8． 在 40ml 洗涤缓冲液 I 中清洗硝酸纤维素膜 10 分钟，然后用 AP 缓冲液平衡 10 分钟。

AP 缓冲液

0.1 mol/L Tris-HCl (pH9.5)

0.1 mol/L NaCl

5 mmol/L MgCl₂

9． 在显色反应中，将膜放入 10ml 含有 66 μ l 氯化硝酸蓝四唑和 33 μ l  5- 溴 -4- 氯 -3- 吲哚磷酸的 AP 缓冲液中，两者均为碱性磷酸酶底物。目的蛋白所在处将出现紫色。通常显色 10 分钟即可获得满意的结果。如果需要更长时间的显色反应，必须在黑暗中进行。

10．  在 20ml 洗涤缓冲液Ⅱ中清洗硝酸纤维素膜 5 分钟，终止显色反应。用 40ml 蒸馏水洗涤 5 分钟后在空气中晾干。

11．  在解剖显微镜观察组织印迹中被染上色的蛋白质。利用透射光和入射光可成功的观察到蛋白质的定位模式。在入射光下可容易观察到物理印迹。为了确认组织印迹中的蛋白质定位，建议将染色的组织印迹和用甲苯酸蓝染色的组织切片进行直接比较。