从基因文库中选择基因

2.1 基因文库
基因文库：是某种特定的生物所含有的能够包含所有基因的足够数目的克隆的集合。基因文库是通过纯化细胞总DNA ，然后利用特定的限制性酶酶切产生能插入载体的片段，一般是λ替换载体、粘粒或者是YAC 。

图5-21 基因文库的构建过程

对于植物、动物，所需要的克隆数很大，鉴定目的基因是一项艰巨的任务。对于这些生物体，可以使用细胞特异的cDNA 文库。cDNA 文库是将mRNA 反转录成cDNA ，插入载体中构建的文库。
每一个细胞都含有相同的基因，但不同细胞中有的基因是表达的， 而有的基因关闭。只有少量基因在所有的细胞类型中都表达，利用mRNA 构建的基因文库，只含有表达的部分基因。例如麸朊（醇溶朊），小麦中的一种营养蛋白，在正发育的种子中，以非常高的水平表达，大约占总mRNA 的30% 。

图5-22 cDNA 文库的构建过程

2.2 克隆的鉴定方法
筛选目的克隆最常用的方法是探针杂交法。
探针是由目的基因的已知的信息决定的，有三种可能性：
1 ） 目的基因在特定细胞中的丰度
2 ） 基因所编码的蛋白质或者部分序列
3 ） 基因是一个基因家族中的一个
2.2.1 利用同源探针筛选目的克隆
任意的两条单链核酸分子都有可能通过碱基配对结合，大部分的配对分子是不稳定的，因为只有少量的碱基配对。然而如果两条链是互补的，大部分碱基可以配对形成稳定的分子。不仅DNA 间可以配对，DNA 与RNA 间也可以进行配对。因此可以使用同源探针筛选目的克隆。
如果克隆的基因所编码的蛋白已知。就可以利用遗传密码子预测相关基因的核苷酸序列，只有蛋氨酸和色氨酸无兼并密码，其他的氨基酸至少有两种密码子。例如丙氨酸有四种密码子，前两位是相同的，GCA,GCT,GCC,GCG ，只能正确的预测两位的碱基。
例如细胞色素C ，从59 号氨基酸的一段序列：Trp-Asp-Glu-Asn-Asn-Met ，相应的DNA 序列是TGG-GA(T/C)-GA(A/G)-AA(T/C)-AA(T/C)-ATG ，在18 个碱基中有14 个是可以预测的。如果用来杂交的18 核苷酸的序列有上千种可能的排列，很显然不适合于合成探针。