基因文库中目的基因的筛选
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克隆基因的方法有很多,根据研究基础的不同,可以使用以下的方法克隆目的基因:
1. PCR 或RT-PCR 法
2. 从基因文库中分离基因
3. 从cDNA 文库中分离基因
4. 转座子标签法
5. 图位克隆法
6. 差减杂交法、扣除杂交、差异显示法
7. 人工合成法
本章中主要介绍从基因文库中筛选目的基因的几种方法。
获的目的克隆的方法有两种
1 ) 目的基因的直接选择
2 ) 从基因文库中筛选
称为鸟枪射击法,建立一个包含所有基因或大部分基因的克隆,从中筛选目的克隆。
<font><span>一</span> </font> 、直接选择
直接选择的基因比较少,如抗生素抗性基因。如克隆一个kan 抗性基因,在R6-5 质粒上含有四种抗性基因:kan, 氯霉素、链霉素、硫胺类药物,kan 抗性基因存在于13 个EcoRI 片段中的一段中。将R6-5 的片段插入pBR322 的EcoRI 位点中,连接混合物中将含有13 个不同片段的大量重组拷贝,其中部分是kan 抗性的。只有含kan 的克隆才能在含有kan 的培养基上正常生长。
1.1 标记援救可以扩大直接选择的范围
利用E. coli 的突变系可扩展该项技术。例如要从E. coli 中克隆trpA 基因,编码色氨酸合成酶,一个突变系不能合成色氨酸,只有加入色氨酸后才能存活。因此E. coli 的突变体可以用来克隆trpA 基因。首先从一个正常个体中提取总DNA ,然后酶切,连接产生大量重组DNA 分子,其中一个将携带完整的trpA 基因。连接混合物用来转化缺陷型E. coli 细胞,大部分转化子是缺陷型的,携带trpA 的重组子将是野生型的,可以在基本培养基上生长。
图5-1 直接选择法克隆Kan 抗性基因
1.2 标记援救的范围和限制
存在两个限制因素:
1 ) 必须存在着目的基因的突变品系
2 ) 需要一种只有野生型能够生长的培养基。
一般而言,标记援救适用于微生物的合成酶,可以在基本培养上选择。
图5-2 标记拯救法克隆trpA 基因