细胞生物基本方法：常规组织培养法

常规组织培养法

 

1 ）初代消化培养法

 

1.      准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒 20 分钟。开始工作前先洗手、 75% 酒精擦拭手至肘部。

2.      布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。

3.      处理组织：把组织块置于烧杯中，用 Hanks 液漂洗 2~3 次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中 30~60 分钟。

4.      剪切：用眼科剪把组织切成 2~3 毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多 30~50 倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。

5.      消化：或用恒温水浴，或置于 37 ℃温箱消化均可，消化中每隔 20 分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。

6.      分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（ 500~1000 转 / 分）离心消化液 5 分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。

7.      计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说， pH 要求在 7.2~7.4 范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用 NaHCO₃ 调整。

8.      培养：置于 36.5 ℃温箱培养，如用 CO₂ 温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。

 

 

2 ）初代组织块培养法

 

1.      剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用 Hanks 液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静 Hanks 液，用眼科剪反复剪切 1mm³ 块为止。

2.      摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以 0.5cm 为宜，每一 25ml 培养瓶底可摆布 20~30 块。

3.      轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置 36.5 ℃温箱培养 2 小时左右（勿超过 4 小时），使小块微干涸。

4.      培养：从微箱中取出培养瓶，开塞， 46 度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶地上的组织小块。置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。

 

 

3 ）传代培养法

1.      吸除培养瓶内旧培养液。

2.      向瓶内加入胰蛋白酶和 EDTA 混合液少许，以能覆满瓶底为限。

3.      置温箱中 2~5 分钟，当发现细胞质回缩，细胞间隙增大后，立即终止消化。

4.      吸除消化液，向瓶内注入 Hanks 液数毫升，轻轻转动培养瓶，把残余消化液冲掉。注意加 Hanks 液冲洗细胞时，动作要轻，以免把已松动的细胞冲掉流失，如用胰蛋白酶液单独消化，吸除胰蛋白酶液后，可不用 Hanks 液冲洗，直接加入培养液。

5.      用吸管吸取营养液轻轻反复吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。

6.      计数板计数后，把细胞悬液分成等份分装入数个培养瓶中，置温箱中培养。