培养细胞染色体显色法

 

培养细胞染色体显示法

 

1）  传代培养细胞染色体显示法

1． 培养细胞：取处于指数生长期、用较大瓶皿培养的、 80 ％～ 90 ％汇合单层培养细胞。

2． 加秋水仙素：使用最终浓度为 0.02 ～ 0.8 微克 / 毫升营养液，温箱继续培养 6 ～ 10 小时；或用低温封闭法：把培养细胞置于 4 ℃条件下 6 ～ 12 小时后，再于 37 ℃温箱继续培养 6 ～ 10 小时处理（加秋水仙素）。

3． 采集分裂细胞：可利用分裂中期细胞体变圆与底物附着不牢特点，此时手持培养瓶，左右反复横向水平摇动，令培养液在培养细胞表面反复冲刷。应用此法可使 90 ％的中期分裂细胞从瓶壁脱落，注意勿用力过猛，以防多量非分裂细胞脱落影响观察。

4． 离心：收集培养液， 1000 转 / 分钟离心 5 ～ 10 分钟。

5． 低渗处理：吸除上清液、加入预温至 37 ℃的 0.075M KCl 溶液，在温箱中静置 20 ～ 30 分钟。

6． 预固定：向悬液中加新鲜 1 ： 3 醋酸、甲醇固定液 1ml ，用吸管吹打调匀，此措施能起到先使细胞表面轻微固定，可防止固定后细胞粘连成块。

7． 固定：离心，同 4 ，吸除上清液，加新鲜固定剂 5 ～ 10ml ；加固定剂时要用一手微斜持离心管，另手用吸管吸取固定剂，把固定剂逐滴滴在离心管壁上，使之慢慢流入离心管中，然后轻轻吹打均匀，置 15 ～ 20 分钟。

8． 重复 7 ，末次离心后，小心吸除大部分上清，据悬液中细胞密度大小，余下固定液 0.5 ～ 1ml 。

9． 制片：用滴片法制片，按如下步骤：彻底洗净载物片，勿留任何油脂，置冰箱中储备备用。滴片前现从冰箱中取出冷载物片 1 片，在载物片表面出现细微水气时，立即向片的一侧滴 2 ～ 3 滴细胞悬液，滴片时的距离能保持半米高度才好。滴片后置室温中令其自然干燥，或用吹风机热风吹干亦可。如此制备好的标本可置盒中备用或立即进行染色观察。

 

10．  染色和封片：一般常用 Giemsa 染色：取干液 Giemsa 1 份加 pH6.8 磷酸缓冲液 9 份混合，染色 10 分钟后，水洗、晾干、可直接观察。如标本需要保存或做长时间观察，可过二甲苯两次后，用中性树胶封片后，再过二甲苯，然后封片亦可。

 

 

2）  人末梢血微量全血培养染色体显示法

 

1． 培养液准备：取 15ml 培养瓶数个，每瓶内分别充入 5ml 培养液（ pH 7.2 ），内含： 1640 培养液（含 10 ％～ 15 ％小牛血清）， PHA 0.1ml ，青霉素 100 单位和链霉素 100 微克 / 毫升 培养液

2． 抽血针管准备：取 2 ～ 5ml 针管一支，在消毒后的无菌操作台或无菌操作箱中安装好注射器，无菌抽肝素（ 100 U/ml BBS ）少许湿润针管，如动作迅速不用肝素亦可。

3． 采血：用棉签 75 ％酒精给患者或献血者的皮肤消毒两次，缚止血带，静脉取血 1 ～ 2ml 。无菌操作迅速向每一瓶培养中加血 0.4 ～ 0.5ml ，如系外出采血，安装针管及分装血液两步骤亦可在无菌条件略差的环境内操作，但动作要迅速，以减少污染；在采血量不多或不应抽血的情况下，亦可在耳垂、手指肚（无名指）用刺血针采血。

4． 培养和加秋水仙素： 37 ℃温箱中培养到 60 ～ 72 小时之间，此时细胞分裂相最多，向每培养瓶内加秋水仙素，最终浓度 0.02 ～ 0.08 微克 / 毫升营养液，再培养 4 ～ 6 小时。

5． 低渗： 1000 转 / 分钟离心 10 分钟，吸除上清液，加入预温过的 0.075M KCl 溶液 10ml ，置温箱中低渗处理 15 ～ 20 分钟。

6． 其余步骤与处理传代细胞法相同。