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显色法

相关实验:谷丙转氨酶的活性测定实验

最新修订时间:

原理

血清谷丙转氨酶(SGPT)能催化丙氨酸与酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸,丙酮酸在酸性条件下与2,4-二硝基苯肼可缩合成丙酮酸二硝基苯腙,该腙在碱性条件下呈现出橙红色,呈色深浅符合比尔定律,在520 nm处有最大吸收。SGPT 在肝脏中含量最高,由于肝细胞损害,该酶逸出血液,可使 SGPT 含量明显增高。因此测定血清谷丙转氨酶的活性可作为肝中毒肝病的重要指标。

材料与仪器

丙酮酸
丙酮 α-酮戊二酸 dl-丙氨酸 2 4-二硝基苯肼 氢氧化钠
恒温水浴锅 722S分光光度计 吸量管 试管 试管架

步骤

溶液配制:

1. 丙酮酸标准溶液:准确称取22 mg纯净丙酮酸钠,用pH 7.4磷酸缓冲液定容至100 ml。

2. SGPT底物溶液:准确称取α-酮戊二酸87.6 mg,dl-丙氨酸5.34g,先用90 ml 0.1  mol/L pH7.4的磷酸缓冲液溶解,然后用20%NaOH溶液调至pH7.4,再以上述磷酸缓冲液稀释至300 ml,冰箱保存可用一周(加氯仿防腐)。
 
3. 0.1 mol/L pH7.4的磷酸缓冲液。
 
4. 2,4-二硝基苯肼溶液:称取19.8 mg2,4-二硝基苯肼,置于100 ml容量瓶中,先用8 ml浓盐酸溶解后,再加水稀释至刻度。
 
5. 0.4  mol/L氢氧化钠溶液。

操作步骤:

1. 标准曲线的绘制:取干燥洁净试管6支,编号,按下表所示添加试剂。
 
 
向每管加0.5 ml2,4-二硝基苯肼,再保温20 min,分别向各管加入0.4 mol/L氢氧化钠溶液5 ml,室温下静置10 min后,用蒸馏水调零点,于520 nm处测光密度。以各管光密度减去空白管光密度为纵坐标,丙酮酸微克数为横坐标作标准曲线。
 
 
2. SGPT活力测定:取洁净干燥试管4支,即测定管、对照管各2支,按下表添加试剂。
 
 
各管反应完毕,混匀,室温下静置10 min后,再以蒸馏水调零点测定光密度。由标准曲线上查得丙酮酸微克数,根据下式计算SGPT 的活力:SGPT 活力(单位)=(测定管微克数-对照管微克数)/2.5×0.1。











 

注意事项

1. 在呈色反应中,2,4-二硝基苯肼可与有酮基的化合物作用形成苯腙,底物中α-酮戊二酸可与之发生反应,生成α-酮戊二酸苯腙。故制作标准曲线时,需要加入一定量的底物以抵消α-酮戊二酸的影响。
 
2.在测定 SGPT 活力时,应事先将底物、血清在37 ℃水浴中恒温,然后在血清管中加入底物,准时计时。
 
3.标准曲线上数值在20~100 U是准确可靠的,超过200 U 时,需将样品稀释。
 
4.丙氨酸应使用 DL-型,不使用 D-型。如使用 L-型,用量减半。
 
5.溶血标本不宜使用,因血细胞内转氨酶活力较高,会影响测定结果。

来源:丁香实验

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