血小板的活化、荧光染色与流式细胞仪分析

 

前言

 

 

血小板活化试验，对于血小板功能、心血管疾病的研究，有重要意义。使用流式细胞仪进行多参数分析，可以特异灵敏地检测血小板表面标记，了解血小板的活化状态和反应性，并同时获得更多关于血小板的信息。在疾病监测、抗血小板治疗病人的筛选及治疗监测、预测并发症等方面有良好的应用前景。

 

 

使用推荐的三色流式分析方法检测血小板活化的优点是：

 

• 检测血小板的反应性。

   

• 了解血小板活化进程。血小板先发生膜糖蛋白变化，然后是胞浆内颗粒释放到血小板外。

   

• 同时检测多种血小板表面标志。

   

• 高度灵敏。

   

• 直接检测血小板的多种标志。

   

• 使用全血，标本量少。

   

• 操作简便快捷，将血小板人工激活减至最低。

   

　　 BDIS 血小板活化试剂组成为：

 

• PAC-1 FITC ：早期血小板活化的标志物，即活化的 gp Ⅱ b/ Ⅲ a 复合物，抗体与活化后血小板膜表面的 gp Ⅱ b/ Ⅲ a 复合物纤维蛋白原结合位点相结合。 BDIS 抗体为 IgM 型，建议使用 PAC-1 结合阻断剂 RGDS 做阴性对照。

   

• CD62P PE ：血小板活化后期的标志物，特异地与活化血小板结合。静止血小板胞浆内 a 颗粒含有 CD62P ，血小板活化时，颗粒内糖蛋白向膜外释放，血小板表面表达 CD62P 。

   

• CD61 PerCP ：特异的泛血小板表面标记，既与活化血小板结合，也与未活化血小板结合。 CD61 与 CD41 联合，即为血小板表面 gp Ⅱ b/ Ⅲ a 复合物。在本试验中，用 FL3 设阈值。

   

试验用品

 

• 采血管：枸橼酸钠抗凝的真空采血管。

   

• 一次性 12 × 75 mm Falcon 试管。

   

• 微量加样器和加样头。

   

• BD 抗体： 2-8 ℃保存。

   

• RGDS (PAC-1 阻断剂 ) ：用 PBS 配制， 10mg/ml 。

   

• 血小板激活剂： ADP ，浓度 2 ′ 10-4M ， 2-8 ℃保存。也可选用其他激活剂，如 PMA 、纤维蛋白、 TRAP 。

   

• PBS 缓冲液：含 0.1%NaN3 ，过滤后 2-8 ℃保存。

   

• 固定液：含 1% 多聚甲醛的 PBS 缓冲液， 2-8 ℃可保存一周。

   

• 振荡混匀器。

   

• FACS 流式细胞仪：进行数据获取。

   

• CaliBRITE Beads/FACSComp 软件： FACS 仪器校正，预设获取条件。

   

• CellQuest 软件：试验数据获取和分析软件。

   

操作步骤

 

 

1.        标本采集：
(1) 采血管顺序编号。
(2) 抽取静脉血，采血管中注入 2ml 。
(3) 于 10 分钟之内完成血小板激活和染色步骤，操作时应注意减少人工激活。

 

 

2.        血小板激活：
(1) 试管内加入 50mlADP ， 450ml 全血，轻轻摇匀。
(2) 室温孵育 5 分钟。
(3) 立即染色。

 

 

3.        荧光抗体染色：
(1)Falcon 管编号。
(2) 在对照管中加入 PE 同型对照、 CD61 PerCP 、 PAC-1 各 20ml ， RGDS 加 10ml 。
(3) 在试验管中加入三种抗体各 20ml 。
(4) 在对照管和试验管中各加入未激活或激活的血标本 5ml 。
(5) 轻轻混匀，室温暗处孵育 15-20 分钟。
(6) 各管中加入 1ml 冷的固定液 (2-8 ℃ ) ，充分混匀， 2-8 ℃阴暗处放置 30 分钟。
(7)24 小时内上机分析。

 

 

4.        上机获取数据：

 

 

(1) 开机：

 

• 检查鞘液筒装满，废液筒倒空。

   

• 先打开流式细胞仪，再打开计算机。

   

• 仪器气路加压，排空气泡。

   

• 做 FACSComp 。

   

(2) 打开 CellQuest ，顺序放置对照管和试验管，获取数据：

 

• 调出 获取条件， FSC 和 SSC 选择 Log 方式。

   

• 获取条件为 CD61 PerCP 阳性。

   

• 使用对照管调整 FL1 和 FL2 的 PMT ，使阴性群体位于 FL1 vs FL2 点图左下角。

   

• 分别使用 PAC-1 FITC / IgG1 PE / CD61 PerCP 和 PAC-1 FITC+ RGDS / CD 62P PE / CD61 PerCP 调整 FL2-FL1 和 FL1-FL2 补偿。

   

• 获取各管的试验数据。

   

5. 结果分析：

 

 

在 CD61 vs SSC 点图中设门找血小板群。 CD61 vs SSC 点图显示有三群， CD61 阳性 / 低 SSC 一群主要由单个血小板组成， CD61 阳性 / 高 SSC 一群主要由黏附血小板的血细胞组成， CD61 阳性 / 散射光更低的一群主要由血小板来源的碎片组成。由于在生理和病理情况下，血小板群和红细胞群的大小、颗粒度会有交叉，因此，不建议使用 FSC-SSC 图设门。

 

 

在 CD61 vs SSC 点图中找出 CD61 PerCP 阳性的血小板群 ( 单个血小板和黏附在 WBC 上的血小板 ) ，设门。门内做 PAC-1 FITC vs CD62P PE 点图的双参数分析，统计结果。

 

 

注意事项

 

 

1.        采血时请用大号针管，抽出的前 2ml 血应弃去不用。

 

 

2.        尽量避免标本受到物理振动。

 

 

3.        取血后 10 分钟内完成染色操作。

 

 

4.        在 Falcon 管中加血标本 5ml ，管壁上不能有残留血，未染色的部分会影响试验结果。

 

 

5. 为了检测和控制血小板体外激活，建议使用正常未受激活的血标本平行做质量控制。

 

 

附： BDIS 血小板活化试剂

 

 

BD 抗体：

 

 

辅助试剂：