血小板的活化、荧光染色与流式细胞仪分析

前言

血小板活化试验，对于血小板功能、心血管疾病的研究，有重要意义。使用流式细胞仪进行多参数分析，可以特异、灵敏地检测血小板表面标记，了解血小板的活化状态和反应性，并同时获得更多关于血小板的信息。在疾病监测、血小板疾病患者的筛选、预测并发症等方面有良好的应用前景。

使用推荐的三色流式分析方法检测血小板活化的优点是：

检测血小板的反应性；了解血小板活化进程；血小板先发生膜糖蛋白变化，然后是胞浆内颗粒释放到血小板外。同时检测多种血小板表面标志；高度灵敏；直接检测血小板的多种标志；使用全血，标本量少；操作简便快捷，将血小板人工激活减至最低。

BDIS血小板活化试剂组成为：

PAC-1 FITC：血小板活化早期的标志物，即活化的 gpⅡb/Ⅲa复合物，抗体与活化后血小板膜表面的gpⅡb/Ⅲa复合物纤维蛋白原结合位点相结合。BDIS抗体为IgM型，建议使用PAC-1结合阻断剂RGDS做阴性对照。

CD62P PE：血小板活化后期的标志物，特异地与活化血小板结合。静止血小板胞浆内a颗粒含有CD62P，血小板活化时，颗粒内糖蛋白向膜外释放，血小板表面表达CD62P。

CD61 PerCP：特异的泛血小板表面标记，既与活化血小板结合，也与静止的血小板结合。CD61与CD41联合，即为血小板表面gpⅡb/Ⅲa复合物。在本试验中，用FL3设阈值。

试验用品

采血管：枸橼酸钠抗凝的真空采血管；一次性12×75 mm Falcon试管；微量加样器和加样头；BD抗体：2-8℃保存。

荧光抗体	FITC	PE	PerCP
对照管	PAC-1+RGDS	IgG1	CD61
试验管	PAC-1	CD62P	CD61

RGDS (PAC-1阻断剂)：用PBS配制，10mg/ml。

血小板激活剂：ADP，浓度2×10－4M，2-8℃保存。也可选用其他激活剂，如PMA、纤维蛋白、TRAP。

PBS缓冲液：含0.1%NaN3，过滤后2-8℃保存。

固定液：含1%多聚甲醛的PBS缓冲液，2-8℃可保存一周。

振荡混匀器。

FACS流式细胞仪：进行数据获取。

CaliBRITE Beads/FACSComp软件：FACS仪器校正，预设获取条件。

CellQuest软件：试验数据获取和分析软件。

操作步骤

1、标本采集：

(1)采血管顺序编号。

(2)抽取静脉血，采血管中注入2ml。

(3)于10分钟之内完成血小板激活和染色步骤，操作时应注意减少人工激活。

2.血小板激活：

(1)试管内加入50μlADP，450μl全血，轻轻摇匀。

(2)室温孵育5分钟。

(3)立即染色。

3、荧光抗体染色：

(1)Falcon管编号。

(2)在对照管中加入PE同型对照、CD61 PerCP、PAC-1各20μl，RGDS加10μl。

(3)在试验管中加入三种抗体各20μl。

(4)在对照管和试验管中各加入未激活或激活的血标本5μl。

(5)轻轻混匀，室温暗处孵育15-20分钟。

(6)各管中加入1ml冷的固定液 (2-8℃)，充分混匀， 2-8℃阴暗处放置30分钟。

(7)24小时内上机分析。

4、上机获取数据：

(1)开机：

检查鞘液筒装满，废液筒倒空。

先打开流式细胞仪，再打开计算机。

仪器气路加压，排空气泡。

做FACSComp。

(2)打开CellQuest，顺序放置对照管和试验管，获取数据：

调出获取条件，FSC和SSC选择Log方式。

获取条件为CD61 PerCP阳性。

使用对照管调整FL1和FL2的PMT，使阴性群体位于FL1 vs FL2点图左下角。

分别使用PAC-1 FITC/IgG1 PE/CD61 PerCP和PAC-1 FITC+ RGDS/CD 62P PE/CD61 PerCP

调整FL2-FL1和FL1-FL2补偿。

获取各管的试验数据。

5、结果分析：

在CD61 vs SSC点图中设门找血小板群。 CD61 vs SSC 点图显示有三群，CD61阳性/低SSC一群主要由单个血小板组成，CD61阳性/高SSC一群主要由黏附血小板的血细胞组成， CD61阳性/散射光更低的一群主要由血小板来源的碎片组成。由于在生理和病理情况下，血小板群和红细胞群的大小、颗粒度会有交叉，因此，不建议使用FSC-SSC图设门。

在CD61 vs SSC点图中找出CD61 PerCP阳性的血小板群 (单个血小板和黏附在WBC上的血小板)，设门。门内做PAC-1 FITC vs CD62P PE点图的双参数分析，统计结果。

     

  Figure5 Unstimulated frwhole blood               

  

Figure6 Unstimulated fresh whole blood(gated on R1)

                                 

Figure7 Unstimulated fresh whole blood(gated on R1)

 Figure8 ADP-stimulated fresh whole blood(gated on R1)    

注意事项

1.采血时请用大号针管，抽出的前2ml血应弃去不用。

2.尽量避免标本受到物理振动。

3.取血后10分钟内完成染色操作。

4.在Falcon管中加血标本5ml，管壁上不能有残留血，未染色的部分会影响试验结果

5.为了检测和控制血小板体外激活，建议使用正常未受激活的血标本平行做质量控制