PVDF膜上蛋白的可逆染色
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PVDF 膜上蛋白的可逆染色
Western 杂交时，为确认蛋白是否转至 PVDF 膜上，可用下列方法对膜上蛋白进行可逆性染色。
1. 氨基黑染色
染液：0.5% Amido Black (w/v), 25% isopropanol (v/v) and 10% acetic acid.
染色：将PVDF膜置于染液中染色数钟，ddH2 O 脱色。
2. 考马氏亮蓝染色
染液：0.1% Coomassie Brilliant Blue R-250 (w/v) and 50% methanol (v/v)
脱色液：40% methanol (v/v) with 10% acetic acid (v/v)
染色：将PVDF膜置于染液中染色15 min.，脱色液脱色。
3．丽春红染色Ponceau S
染液：0.2% w/v Ponceau S in TCA (3% v/v)
染色：将PVDF膜置于染液中染色5min
脱色：ddH2 O 脱色
三、银染
PAGE胶上蛋白质的银染方法有数百种，其原理相似，具体步骤各不相同。银染为蛋白质的非特异性染色，呈“爆炸性”反应模式，用于蛋白定量时准确性差，但其敏感度高、简便易行，仍被广泛应用。下面列举的这三种方法为常用的双向电泳凝胶染色法，可与质谱兼容。其中方法1敏感性最高，方法3背景最低、对比度好。
1. Blam silver staining protocol (Modified)
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程序 |
溶液 |
时间 |
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固定
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40%ETOH 10%HAC |
1小时
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漂洗 |
30%ETOH |
2×20min |
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致敏 |
0.02%Na2 S2 O3 |
1min |
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漂洗 |
H2 O |
3×20Secs |
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染色 |
0.1%AgO3 (预冷) |
4℃，20mins |
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漂洗
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H2 O H2 O(更换盘子) |
3×20Secs 1min |
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显色
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3%Na2 CO3 0.05%甲醛 |
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漂洗 |
H2 O |
20Secs |
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中止 |
5%Hac |
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漂洗 |
H2 O |
3×10min |
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贮存 |
1%Hac,4℃ |
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2. EMBL Silver Staining Protocol
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程序 |
溶液 |
时间 |
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固定
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50%MeOH 5%HAc |
20min
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漂洗 |
H2 O |
2hr或过夜 |
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致敏 |
0.02%Na2 S2 O3 |
1min |
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漂洗 |
H2 O |
2×1min |
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染色 |
0.1AgNO3 (预冷) |
20min |
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漂洗 |
H2 O |
2×1min |
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显色
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2%Na2 CO3 0.04%甲醛 |
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中止 |
5% HAc |
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贮存 |
1% HAc，4℃ |
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3. Vorum Silver Staining Protocol
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程序 |
溶液 |
时间 |
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固定
漂洗
致敏
漂洗 染色
漂洗 显色
中止
贮存 |
50%MeOH 12%HAc 0.05%甲醛
35%EtOH
0.02%Na2 S2 O3
H2 O 0.2AgNO3 0.076%甲醛 H2 O 6% Na2 CO3 0.05%甲醛 0.0004% Na2 S2 O3 50%MeOH 12%HAc 1%HAc，4℃ |
2hr或过夜
3×20mins
2min
3×5mins 20min
3×5mins
5mins |
注意事项：
1.应严格按照操作步骤进行；
2.显色前最好更换新染色盘；
3.显色时变为黄色或棕色后立即弃去，更换新鲜显色液，一般来说染一块胶应配制500ml染液。更换2-3次；
4.市售甲醛的浓度为37%；
5.三种方法均与质谱兼容，Blum法敏感性高，但背景呈淡黄色，EMBL法次之但背景较低，染色点较黑。Vorum相对不敏感，但背景清晰，信噪比高。
