PVDF膜上蛋白的可逆染色

互联网2013-09-06

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PVDF 膜上蛋白的可逆染色

Western 杂交时，为确认蛋白是否转至 PVDF 膜上，可用下列方法对膜上蛋白进行可逆性染色。

1. 氨基黑染色

染液：0.5% Amido Black (w/v), 25% isopropanol (v/v) and 10% acetic acid.

染色：将PVDF膜置于染液中染色数钟，ddH₂ O 脱色。

2. 考马氏亮蓝染色

染液：0.1% Coomassie Brilliant Blue R-250 (w/v) and 50% methanol (v/v)

脱色液：40% methanol (v/v) with 10% acetic acid (v/v)

染色：将PVDF膜置于染液中染色15 min.，脱色液脱色。

3．丽春红染色Ponceau S
染液：0.2% w/v Ponceau S in TCA (3% v/v)

染色：将PVDF膜置于染液中染色5min

脱色：ddH₂ O 脱色

三、银染

PAGE胶上蛋白质的银染方法有数百种，其原理相似，具体步骤各不相同。银染为蛋白质的非特异性染色，呈“爆炸性”反应模式，用于蛋白定量时准确性差，但其敏感度高、简便易行，仍被广泛应用。下面列举的这三种方法为常用的双向电泳凝胶染色法，可与质谱兼容。其中方法1敏感性最高，方法3背景最低、对比度好。

1. Blam silver staining protocol (Modified)

程序	溶液	时间
固定	40%ETOH 10%HAC	1小时
漂洗	30%ETOH	2×20min
致敏	0.02%Na₂ S₂ O₃	1min
漂洗	H₂ O	3×20Secs
染色	0.1%AgO₃ (预冷)	4℃，20mins
漂洗	H₂ O H₂ O(更换盘子)	3×20Secs 1min
显色	3%Na₂ CO₃ 0.05%甲醛
漂洗	H₂ O	20Secs
中止	5%Hac
漂洗	H₂ O	3×10min
贮存	1%Hac,4℃

2. EMBL Silver Staining Protocol

程序	溶液	时间
固定	50%MeOH 5%HAc	20min
漂洗	H₂ O	2hr或过夜
致敏	0.02%Na₂ S₂ O₃	1min
漂洗	H₂ O	2×1min
染色	0.1AgNO₃ (预冷)	20min
漂洗	H₂ O	2×1min
显色	2%Na₂ CO₃ 0.04%甲醛
中止	5% HAc
贮存	1% HAc，4℃

3. Vorum Silver Staining Protocol

程序

溶液

时间

固定

漂洗

致敏

漂洗

染色

漂洗

显色

中止

贮存

50%MeOH

12%HAc

0.05%甲醛

35%EtOH

0.02%Na₂ S₂ O₃

H₂ O

0.2AgNO₃

0.076%甲醛

H₂ O

6% Na₂ CO₃

0.05%甲醛

0.0004% Na₂ S₂ O₃

50%MeOH

12%HAc

1%HAc，4℃

2hr或过夜

3×20mins

2min

3×5mins

20min

3×5mins

5mins

注意事项：

1.应严格按照操作步骤进行；

2.显色前最好更换新染色盘；

3.显色时变为黄色或棕色后立即弃去，更换新鲜显色液，一般来说染一块胶应配制500ml染液。更换2-3次；

4.市售甲醛的浓度为37%；

5.三种方法均与质谱兼容，Blum法敏感性高，但背景呈淡黄色，EMBL法次之但背景较低，染色点较黑。Vorum相对不敏感，但背景清晰，信噪比高。

PVDF膜上蛋白的可逆染色

3．丽春红染色Ponceau S 染液：0.2% w/v Ponceau S in TCA (3% v/v)

染色：将PVDF膜置于染液中染色5min

脱色：ddH2 O 脱色

3．丽春红染色Ponceau S
染液：0.2% w/v Ponceau S in TCA (3% v/v)

脱色：ddH₂ O 脱色