叶绿体被膜完整性的测定

一、原理

由于玻璃氰化钾不能透过被膜，故完整叶绿体在等渗介质中不能进行玻璃氰化钾光还原的Hill反应。而失去完整被膜的叶绿体，铁氰化钾可以进入类囊体进行Hill反应。根据这一原理，比较胀破与未胀破的叶绿体Hill反应速率，就可计算叶绿体被膜的完整度。

二、仪器与用具

氧电极测氧全套装置；烧杯；微量进样器；洗耳球等。

三、试剂

测定介质Ⅰ和Ⅱ  见“叶绿体的分离”。

100mmol/L铁氰化钾：称3.29g铁氰化钾溶于水，定容至100ml。

100mmol/L NH₄ Cl：称0.54g NH₄ Cl溶于水，定容至100ml。

适量叶绿体（20~50μg Chl/ml反应体系）。

四、方法

1. 取0.1ml叶绿体提取液加到0.9ml的蒸馏水中并搅拌1min，使叶绿体被膜胀破，加1ml测定介质Ⅰ悬浮备用。

2. 取0.1ml未胀破叶绿体提取液加入反应杯中，视反应杯体积加入测定介质Ⅱ，加入适量铁氰化钾和NH4Cl，使铁氰化钾和NH4Cl的最终浓度都为1mmol/L。搅拌，平衡1min，照光测定Hill反应放氧速率，记录5min，然后清洗反应杯。

3. 将已胀破叶绿体加入反应杯中，再加入适量测定介质Ⅱ、铁氰化钾和NH4Cl，使反应体系物质最终浓度同未胀破叶绿体测定体系，测定过程同2。

4. 分别计算胀破和未胀破的叶绿体测定体系中单位时间的放氧量（或Hill反应速率）。

5. 计算被膜完整度。

式中  A-胀破叶绿体单位时间内的放氧量（或Hill反应速率）

B-未胀破叶绿体单位时间内的放氧量（或Hill反应速率）

五、注意事项

1. 本实验所用玻璃要存放在冰箱中，存放时间不宜过长，最好现配现用。

2. 叶绿体的分离要在0~4℃下进行，玻璃器皿和溶液都须预冷，操作要快，整个分离过程最好在5min内完成。

3. 离心过程中离心机的转速不宜过高，否则叶绿体中的淀粉粒会打破叶绿体被膜。

4. 被膜完整度的测定过程中，反应杯内破碎叶绿体与完整叶绿体的叶绿素含量应相等。