引物的熔解温度与退火温度

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primer的一个重要参数是熔解温度(Tm)。这是当50%的primer和互补序列表现为双链DNA 分子时的温度.Tm对于设定PCR退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证primer同目的序列有效退火， 同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比primer的 Tm低5℃。

设定Tm有几种公式。有的是来源于高盐溶液中的杂交 ，适用于小于18碱基的primer。

有的是根据GC含量估算Tm。确定primerTm最可信的方法是近邻分析法。这种方法从序列一级结构 和 相邻碱基的特性预测primer的杂交稳定性。大部分计算器程序使用近邻分析法。

根据所使用的公式及primer序列的不同，Tm会差异很大。因为大部分公式提供一个估算的Tm值，所有退火温度只是一个起始点。可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。开始低于估算的Tm5℃，以2℃为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少primer二聚体和非特异性产物的形成。

为获得最佳结果，两个primer应具有近似的Tm值。primer对的Tm差异如果超过5℃，就会primer在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果两个primerTm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5℃

或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。