植物体内可溶性蛋白质含量的测定:考马斯亮蓝G－250染色法

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【原理】

考马斯亮蓝G－250(GooMAssIe BrIllIAnT Blue G－250)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G－250在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中，当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nM，后者在595nM。在一定蛋白质浓度范围内(1～100μg)，蛋白质与色素结合物在595nM波长下的光吸收与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G－250结合在2Min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1H内保持稳定。该反应快速灵敏(灵敏度比ＦolIn－酚法还高4倍)、易于操作、干扰物质少(考马斯亮蓝G－250和蛋白质通过范德华力结合，受蛋白质的特异性影响较小，除组蛋白外，其他不同种类蛋白质染色强度差异不大)，可测定微克级蛋白质含量，是一种比较好的蛋白质定量法。但此方法也存在其缺点，考马斯亮蓝在蛋白质含量很高时线性关系偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有差异。

【仪器与用具】

721分光光度计 ；10Ml量筒1个；研钵；烧杯；量瓶；移液管：1Ml 3支，01Ml 3支；10Ml具塞刻度试管14支。

【试剂】

标准蛋白质溶液：用牛血清白蛋白配成含蛋白质100μg／Ml的标准蛋白溶液;

90％乙醇；

85％磷酸(W／V)；

考马斯亮蓝G－250溶液：称取100μg考马斯亮蓝G－250，溶于50Ml 90％乙醇中，加入85％的磷酸100Ml，最后用蒸馏水定容到1000Ml，贮放在棕色瓶中，此溶液在常温下可放置1个月。

【方法】

1标准曲线(蛋白质含量为0～100μg／Ml)的绘制　取6支具塞试管，按表2－1数据配制含0～100μg／Ml的牛血清蛋白 质液各1Ml。

表2－1不同蛋白质含量的牛血清蛋白质液配制表

管号123456蛋白质标准液（ml)00.200.400.600.801.00蒸馏水（ml)1.000.800.600.400.200蛋白质含量（μg）020406080100在每支试管中加入5Ml考马斯亮蓝G－250溶液，盖塞，反转混合数次，放置2Min后，用1CM光径比色杯在595nM下比色。以蛋白质浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标绘制标准曲线。

2.样品提取液中蛋白质浓度的测定　吸取样品提取液1.0Ml(样品提取见LoWry法)，放入具塞试管中(每个样品设置两个重复)，加入5Ml考马斯亮蓝G－250溶液，充分混合，放置2Min后在595nM下比色，记录吸光值，并通过标准曲线查得蛋白质含量。

3结果计算

样品中蛋白质的含量(Mg／g)＝C×VTV1×FW×1000（2-2）

式中C：查标准曲线值(μg)；VT：提取液总体积(Ml)；

ＦW：样品鲜重(g)； V1：测定时加样量(Ml)。