福林－酚法植物体内可溶性蛋白质含量的测定汇总

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该方法是双缩脲法的发展，包括两步反应：

(1)在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质—铜络合物。

(2)此络合物将试剂磷钼酸—磷钨酸(FolIn试剂)还原，混合物深蓝色(磷钼蓝和磷钨蓝混合物)，颜色深浅与蛋白质含量成正比。此方法操作简便，灵敏度比双缩脲法高100倍，定量范围为5~100μg蛋白质。FolIn试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸引起，因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物，均有干扰作用。此方法的缺点是有蛋白质的特异性影响，即不同蛋白质因络氨酸、色氨酸含量的不同而使显色强度稍有不同，标准曲线也不是严格的直线形式。

一、仪器与用具

试管若干;刻度移液管05Ml 1支，1Ml 1支，10Ml 1支;定量加样器;圆底烧瓶;冷凝管1套(带橡胶管);微量滴定管;小烧杯;微量进样器50μl 1支;721分光光度计 ;恒温水浴器;研钵;玻棒;离心机;离心管。

二、试剂

Na2WO4·2H2O;Na2MoO4·2H2O;85%H3PO4;浓HCl;Li2SO4·H2O;溴水;酚酞指示剂;Na2CO3;NaOH;CuSO4·5H2O;酒石酸钾钠;牛血清白蛋白。所用试剂均为化学纯或分析纯。

三、方法

1. 试剂的配制

(1)碱性铜试剂(相当于双缩脲试剂)的制备首先配制A液：4%碳酸钠(Na2CO3)溶液与0.2mol/L氢氧化钠(NaOH)溶液等比例混合(2%Na2CO3，0.1Mol NaOH);B液：1%硫酸铜(CuSO4·5H2O)溶液与2%酒石酸钾钠溶液等比例混合(0.5%CuSO4·5H2O，0.1%酒石酸钾钠)。在使用前将A液与B液按50∶1的比例混合即成。此为Folin-酚试剂甲液，此试剂只能使用1天。

酚试剂(相当于Folin试剂)的配备：称取钨酸钠(Na2WO4·2H2O)100g、钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)25g，加蒸馏水700Ml溶解于1500Ml的圆底烧瓶中。之后加入85%的H3PO450ml，浓HCl 100ml，安上回流装置(使用磨口接头，若用软木塞或橡皮塞时，就必须用锡铂纸包起来)，使其慢慢沸腾10H。冷却后加入硫酸锂(Li2SO4·H2O)150g，水50ml，溴水2~3滴，不用回流装置开口煮沸15min，以释放出过量的溴。待冷却后稀释至1000ml，并过滤入棕色瓶中，密闭于冰箱中保存(冷却后溶液呈黄色，倘若仍呈绿色，须再滴加数滴液体溴，继续煮沸15min)。使用时用标准NAOH溶液滴定，以酚酞作为指示剂，滴定终点由蓝变灰，滴定后算出酸的浓度。使用时大约加水1倍，使最终浓度相当于1Mol/L H+酸，此为FolIn-酚试剂乙液(Folin试剂)。

在测定时要注意，因为酚试剂仅在酸性条件下稳定，但此实验的反应只在PH值为10的情况下发生，所以当加酚试剂时，必须立即混匀，以便在磷钼酸—磷钨酸试剂被破坏前即能发生还原反应，否则会使显色程度减弱。

(2)标准蛋白质溶液的配制 称取25mg牛血清白蛋白，溶于100ml蒸馏水中，使最终浓度为250μg/ml。

2. 标准曲线的绘制

(1)取7支试管，编号后，分别加入0ml、0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml标准蛋白质溶液，用蒸馏水补足1Ml，使每管含蛋白量分别为0μg、25μg、50μg、100μg、150μg、200μg、250μg(必要时可做重复)。

(2)在每支试管中用定量加样器加入5ml甲液，混匀，于30℃下放置10min。

(3)在每支试管中喷射加入0.5ml乙液，立即振荡混匀，在30℃下保温30min。