原理
在生物体中，氧作为电子传递的受体，得到单电子时，生成超氧阴离子自由基（O2－）。
利用羟胺氧化的方法可以测定生物系统中O2－含量。O2－与羟胺反应生成NO2－，NO2－在对氨基苯磺酸和α－萘胺的作用下，生成粉红色的偶氮染料（对－苯磺酸－偶氮－α－萘胺）。取生成物在530nm波长处测定吸光度（A）值，根据A530值可以算出样品中O2－含量。反应式如下：
利用羟胺氧化的方法可以测定生物系统中O2－含量。O2－与羟胺反应生成NO2－，NO2－在对氨基苯磺酸和α－萘胺的作用下，生成粉红色的偶氮染料（对－苯磺酸－偶氮－α－萘胺）。取生成物在530nm波长处测定吸光度（A）值，根据A530值可以算出样品中O2－含量。反应式如下：
材料与仪器
花生 绿豆 大豆黄化幼苗
磷酸缓冲液 盐酸羟胺 对氨基苯磺酸 α－萘胺 NaNO2母液
高速冷冻离心机 分光光度计 恒温水浴锅 研钵 试管 移液管 试管架 移液管架 洗耳球
磷酸缓冲液 盐酸羟胺 对氨基苯磺酸 α－萘胺 NaNO2母液
高速冷冻离心机 分光光度计 恒温水浴锅 研钵 试管 移液管 试管架 移液管架 洗耳球
步骤
一、材料仪器设备及试剂
1. 材料：花生、绿豆、大豆黄化幼苗的下胚轴及其他植物叶片。
2. 仪器设备：高速冷冻离心机，分光光度计，恒温水浴锅，研钵，试管，移液管，试管架，移液管架，洗耳球等。
3. 试剂配制：
50 mmol·L－1磷酸缓冲液（pH7.8）
1 mmol·L－1盐酸羟胺
17 mmol·L－1对氨基苯磺酸（以冰醋酸 ：水 = 3 ：1配制）
7 mmol·L－1 α－萘胺（以冰醋酸 ：水 = 3 ：1配制）
50nmol· ml－1NaNO2母液
二、实验步骤
1. 提取液制备
称取1g植物叶片放入冰浴的研钵中，加入50mmol·L－1磷酸缓冲液（pH7.8）5 ml, 研磨成匀浆，在1000r/min，4℃下离心10min，取上清液再以15000r/min，4℃下离心20min，第二次上清液即为样品提取液。
2. 亚硝酸根标准曲线的制作
2.1系列浓度NaNO2溶液的配制
取50nmol· ml－1NaNO2母液，分别稀释成0、10、20、30、40和50、nmol· ml－1的标准稀释液。
2.2取7支试管，编0～6号，分别加10、15、20、30、40、50、nmol· ml－1NaNO2标准稀释液1 ml，0号管加蒸馏水1 ml，然后各管再加50mmol·L－1磷酸缓冲液1 ml，17 mmol·L－1对氨基苯磺酸1 ml和7 mmol·L－1 α－萘胺1 ml，置于25℃显色20min后，以0号管作空白对照，在530nm波长处测定吸光度（A）值。
2.3 标准曲线绘制
以1～6号管亚硝酸根（NO2－）浓度为横坐标，吸光度值作纵坐标，绘制标准曲线。
3. O2－含量测定
取4支试管，编0～3号，1～号管分别加入样品提取液0.5 ml（三个重复），0号管加蒸馏水0.5 ml，然后各管加入50mmol·L－1磷酸缓冲液0.5 ml，1 mmol·L－1盐酸羟胺1 ml，混匀，置于25℃ 1 h后，各管再加入17 mmol·L－1对氨基苯磺酸1 ml和7 mmol·L－1α－萘胺1 ml，混匀，置于25℃显色20min，以0号管为空白对照，在530nm波长处测定吸光度（A）值。
三、结果计算
根据所测得的A530值，从标准曲线上查得样品中NO2－浓度，按公式（1）即可计算出样品中NO2－浓度。然后依据羟胺与O2－的上述反应，从NO2－对O2－进行化学计量，按公式（2）计算，即将按公式（1）计算得到的NO2－浓度乘2，得O2－浓度。也可根据被测样品与羟胺反应的时间和样品中蛋白质含量，按公式（3）求得O2－的生产率。
1. 材料：花生、绿豆、大豆黄化幼苗的下胚轴及其他植物叶片。
2. 仪器设备：高速冷冻离心机，分光光度计，恒温水浴锅，研钵，试管，移液管，试管架，移液管架，洗耳球等。
3. 试剂配制：
50 mmol·L－1磷酸缓冲液（pH7.8）
1 mmol·L－1盐酸羟胺
17 mmol·L－1对氨基苯磺酸（以冰醋酸 ：水 = 3 ：1配制）
7 mmol·L－1 α－萘胺（以冰醋酸 ：水 = 3 ：1配制）
50nmol· ml－1NaNO2母液
二、实验步骤
1. 提取液制备
称取1g植物叶片放入冰浴的研钵中，加入50mmol·L－1磷酸缓冲液（pH7.8）5 ml, 研磨成匀浆，在1000r/min，4℃下离心10min，取上清液再以15000r/min，4℃下离心20min，第二次上清液即为样品提取液。
2. 亚硝酸根标准曲线的制作
2.1系列浓度NaNO2溶液的配制
取50nmol· ml－1NaNO2母液，分别稀释成0、10、20、30、40和50、nmol· ml－1的标准稀释液。
2.2取7支试管，编0～6号，分别加10、15、20、30、40、50、nmol· ml－1NaNO2标准稀释液1 ml，0号管加蒸馏水1 ml，然后各管再加50mmol·L－1磷酸缓冲液1 ml，17 mmol·L－1对氨基苯磺酸1 ml和7 mmol·L－1 α－萘胺1 ml，置于25℃显色20min后，以0号管作空白对照，在530nm波长处测定吸光度（A）值。
2.3 标准曲线绘制
以1～6号管亚硝酸根（NO2－）浓度为横坐标，吸光度值作纵坐标，绘制标准曲线。
3. O2－含量测定
取4支试管，编0～3号，1～号管分别加入样品提取液0.5 ml（三个重复），0号管加蒸馏水0.5 ml，然后各管加入50mmol·L－1磷酸缓冲液0.5 ml，1 mmol·L－1盐酸羟胺1 ml，混匀，置于25℃ 1 h后，各管再加入17 mmol·L－1对氨基苯磺酸1 ml和7 mmol·L－1α－萘胺1 ml，混匀，置于25℃显色20min，以0号管为空白对照，在530nm波长处测定吸光度（A）值。
三、结果计算
根据所测得的A530值，从标准曲线上查得样品中NO2－浓度，按公式（1）即可计算出样品中NO2－浓度。然后依据羟胺与O2－的上述反应，从NO2－对O2－进行化学计量，按公式（2）计算，即将按公式（1）计算得到的NO2－浓度乘2，得O2－浓度。也可根据被测样品与羟胺反应的时间和样品中蛋白质含量，按公式（3）求得O2－的生产率。
注意事项
如果样品中含有大量叶绿素将干扰测定，可在样品液与羟胺温浴后，加入等体积乙醚提取叶绿素。
来源：丁香实验
