叶绿体光诱导荧光强度的测定

相关专题

 

一、原理
叶绿体 色素在照光时能辐射出荧光。研究叶绿体色素荧光性质，有助于了解它的分子激发态，分子之间的能量传递以及分子在活体内的排列。叶绿体光诱导荧光强度的变化（以下简称可变荧光）是由于叶绿体吸收光能后，光能在转化和电子传递过程中受阻，能量不能正常的传递下去，而以荧光的形式释放出来，使荧光的强度增加。如果这种变化是由光的影响引起的，就叫光诱导的可变荧光。当然，也可由其它条件诱导的可变荧光。在室温条件下，叶绿体在685nm处呈现一个荧光发射峰，它是由光系统II发射出来的，这部分荧光称为固定荧光（F0），是物理性的，它与光系统II的原初反应和电子传递无关当对叶绿体进行光诱导时，而发射出的荧光叫可变荧光（ΔF）。固定荧光和可变荧光之和称为总荧光（Fmax）。由此可见，可变荧光（ΔF）可以代表光系统II反应中心可能利用及转化能量的能力。所以，ΔF在一定程度上代表光系统II反应中心的活性。而可变荧光与固定荧光的比值则表示光系统II的光能转换效率。因此，可作为叶绿体光化学活性的一个重要指标。

二、材料、仪器设备 及试剂
材料：玉米、菠菜叶片
仪器设备：1.冰箱；2.组织捣碎机；3.冷冻离心机；4.玻璃匀浆器；5.动力学分光光度计 。

（三）试剂：叶绿体制备缓冲液（简称制备液）。
0.05mol/L 磷酸缓冲液，内含0.3mol/L 蔗糖和0.1mol/L KCl，pH7.2。
三、实验步骤
1. 叶绿体的制备　称取10g弃去大叶脉的新鲜植物叶片，先用自来水冲洗，再用蒸馏水洗净，吸干水分后，放在冰箱里冷冻。然后用剪刀剪碎，置于预冷的组织捣碎机的玻璃缸内，加入50ml制备液，用4层纱布将匀浆过滤，滤液在0℃下用1000×g离心10min。弃去上清液，在沉淀中加入40ml制备液悬浮，再次用1000×g离心10min，取出沉淀，用15ml制备液在玻璃匀浆器内匀浆，则得叶绿体悬浮液备用。
2. 将仪器调整好，并把必要的参数调到预定值，使仪器运转正常。在光电倍增管前加一个684nm的滤光片，并把激发光波长调到436nm或480nm。
3. 调整基线　将空白缓冲液倒入比色杯中，放入样品室的样品架上，打开激发光谱录基线，如果信号过大，说明滤光片漏光，需更换。
4. 样品测定　将待测的叶绿体样品放入比色杯，并放到样品室内。打开激发光，记录固定荧光。再打开诱导光，记录最大荧光强度（Fmax）。

四、结果计算：
根据记录的图谱，计算出固定荧光（F0）和总荧光（Fmax）的数值，并按下述公式计算可变荧光和可变荧光产率。可变荧光ΔF＝Fmax－F0；可变荧光率＝ΔF/F0