细菌染色技术（单染技术与革兰氏染色）

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细菌 个体微小，普通光学显微镜下不易直接观察，故常用染色技术使细菌细胞着色。包括细菌单染技术、细菌的革兰氏染色技术、细菌的芽孢染色技术、细菌的荚膜染色技术和细菌的鞭毛染色技术

Ⅰ、细菌的单染技术
简单染色通常只用一种染色剂，使细菌整个细胞染上颜色。但看不清结构。所以只便于检查细菌的形态、大小和排列方式等。
【实验目的】
1、掌握单染色的操作技术
2、观察细菌的基本形态
【实验原理】
单染色即用单纯的种染料进行染色，多数采用美蓝、结晶紫或石碳酸复红等碱性染料。此法仅能显示细胞的外部形态，而不能辨别其内部结构。染色前必须将细胞固定，其目的是杀死细菌，并使它粘附在载玻片上。此外，还可以增加菌体对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法。无论用哪种方法都应尽量使细菌维持原有的形态，防止细胞膨胀或收缩。
【实验材料、药品及器具】
1、菌种 大肠杆菌 （Escherichia coli）
枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）
2、染色液 石炭酸品红染色或结晶紫染色液（Stining Solutions）
3、无菌水
4、洗瓶装蒸馏水
5、洗净的载玻片（Slicle）5片
6、显微镜、香柏油、接种环、酒精灯、擦镜纸、吸水纸、二甲苯
【实验步骤】
1、涂片：取一片干净无油载玻片，在其中央滴一滴无菌水，然后用接种环以无菌操作方法取少许培养好的大肠杆菌，放在载玻片的水滴中涂匀，注意菌量不宜过多，否则，不易看清单个菌体。
2、固定：将涂好的玻片在空气中风干或火焰上通过3～4 次，使水份蒸发，此时细菌菌体紧贴在玻片上。
3、染色：用石炭酸品红或结晶紫染色剂30~60S，然后用洗瓶轻轻冲洗染色剂（注意不要直接冲洗染色部位），直至无多余的染液，晾干或用吸水纸从旁吸干或用微火烘干。
4、用同样方法将枯草芽孢杆菌制作一张涂片。
5、镜检：首先在低倍镜下找到物像，然后在涂膜中央滴一滴香柏油，换成油浸镜观察两个菌种的形态和排列。
6、去除油镜上的香柏油：先用干净的擦镜纸擦2-3 次，再换另一张擦镜纸蘸取少许二甲苯以除去残留的香柏油，最后用擦镜纸擦干。擦镜头时应顺着镜头直径方向擦，不要沿着圆周方向擦。
【实验结果】
1、绘制观察到大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的形态图，并注明放大倍数。
2、用文字描述两菌株的细胞形态。
【思考题】
1、涂片在染色前为什么要先进行固定？固定时应注意什么问题？
2、制片为什么要完全干燥后才能用油镜观察？
3、制片时应注意哪些事项？为什么？

Ⅱ、细菌的革兰氏染色
革兰氏染色是细菌鉴定上一个最重要和广泛应用的方法。根据此法染色结果可将细菌分成两大类。一类细菌能够保留初染色剂（结晶等）于细胞中，不受脱色剂（酒精）的影响，而最后细菌被染成紫色或深蓝色者称为革兰氏阳性（Gram-positive）；另一类细菌可因脱色剂的作用而洗出结晶紫，然后被另一染色剂（藏红花）染成红色，称为革兰氏阴性（Gram-negative）。也有一些菌种革兰氏染色是可变的。
【实验目的】
了解革兰氏染色的原理，并掌握革兰氏染色法的操作技术。
【实验原理】
革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种重要的鉴别染色法。1884 年由丹麦医师Gram创立。
细菌先经碱性染料结晶紫染色，再经碘液媒染（以增加染料与细胞的亲和力）后，用酒精或丙酮脱色，再用复染色剂染色。不被脱色而保持原颜色者为革兰纸阳性菌（G+）；被脱色后又被染上复染剂的颜色者为革兰氏阳性菌（G-）。此法可将细菌分为两大类。
革兰氏染色的机理主要是利用两类细菌的细胞壁成分和结构不同。革兰氏阴性菌的细胞壁中含有较多的类脂质，而肽聚糖的含量较少。当用乙醇或丙酮脱色时，类脂质被溶解，增加了细胞壁的通透性，使初染后的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细胞被脱色，经复染后，又染上复染液的颜色；而革兰氏阳性菌细胞壁中肽聚糖的含量多且交联度大，类脂质含量少，经乙醇或丙酮洗脱后，肽聚糖层的孔径变小，通透性降低，因此，细胞仍保留初染时的颜色。
【实验材料、药品及器具】
1、菌种 大肠杆菌（Escherichia coli）
枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）
金黄色葡萄球菌（Staphylococeus auresu）
2、染液 草酸铵结晶紫液
革兰氏碘液
95%的酒精
藏花红液
3、器皿洗净的载玻片6 片、显微镜、酒精灯、接种环、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、镊子、玻璃缸、瓶装蒸馏水
【实验步骤】
1、取培养12-24h的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌分别涂片、固定。
2、加草酸铵结晶紫染色剂一滴，染色1 分钟。
3、倾去染液并用洗瓶装水轻轻冲洗。