核酸原位杂交技术

相关专题

 

分子生物学技术的突飞猛进发展，也推动了病理学的进展。原位杂交 技术时分子生物学领域中最常用的基本技术方法之一，是核酸分子杂交技术中的一种。
核酸原位杂交技术最早应用于60年代末期，但当时仅限于对体外条件下啊核酸分子片段的初步工作，直到1975年才见到较为系统地介绍在细胞内进行原位杂交的技术。而在常规福尔马林固定，石蜡包埋的组织切片中进行简便易行的原位杂交则是在80年代中后期。近年来，随着方法更为完善，应用也更加广泛，使原来用电镜和免疫组织方法达到的亚细胞和抗原 决定族水平的分辨能力提高到了核酸分子的水平，将病理组织学观察到的细胞面貌更直实更微细更精确地展示出来。

核酸原位杂交的基本原理

核酸分子 杂交是只具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下（适宜的温度和离子强度等）可按碱基互补原则退火（annealling）形成双链的过程。这一杂交过程具有高度的特异性。
杂交的双方时待测核酸序列及探针。待测的核酸序列可以是克隆的基因片段，也可以是未克隆化的基因组DNA核细胞总RNA。将核酸从细胞中分离纯化后可以在体外与探针杂交（膜上印迹杂交），也可以直接在细胞内进行（原位杂交）。
用于检测的已知核酸片段称之为探珍（probe）。为了便于示踪，探针必须用一定的手段加以标记，以利于以后的检测。常用的标记物包括放射性核素和非放射性标记物两大类。检测这些标记物的方法都是极其灵敏的。
由于DNA分子双股螺旋在一定条件下可以解开（退火），而解开的双螺旋经重新配对后又能形成新的螺旋（复性），针对这一生物学特性，就可以用已知的核酸片段去检测未知的核酸分子，并能确定其所在的部位，达到定位和定量的目的。例如，用特异性的细菌、病毒的核酸作为探针对组织、细胞进行杂交，以便有无该病原体的感染。
原位杂交能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受统一组织中其他成分的影响，因此，对那些细胞数量少而散在分布于其他啊组织中的细胞内DNA或RNA的研究更为方便。
原位杂交不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，并可完整地保护组织和细胞的形态，更能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态。

核酸原位杂交的主要过程

核酸原位杂交按检测物的不同，分为细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交。根据所用探针及所要检测核酸的不同又可分为DNA-DNA,RNA-DNA,RNA-RNA杂交。但不论哪一种形式的杂交，都必须经过五大过程，即组织细胞的固定，预杂交、杂交、冲洗和显示。
一．组织细胞的固定
进行核酸原位杂交的组织或细胞必须经过固定处理。适宜核酸杂交的理想的固定液应具备下列特点：1.能很好地保护组织细胞的形态。2.对核酸无抽提、修饰与降解作用。3.不改变核酸在细胞内的定位。4.对核酸与探针的杂交过程无阻碍作用。5.对杂交信号无遮蔽作用。6.理化性质稳定、价格低廉。
病理组织学常用的固定液均可用与核酸原位杂交是组织和细胞的固定，但各具优缺点。一般而言，4%多聚加全市应用最为广泛的固定液之一，它能很好地保持组织或细胞内的RNA，一般固定10-15分钟RNA的含量比较恒定。10%的甲醛液虽然可促进DNA双链分子的交联进而变性，但用含50%的甲酰胺杂交液进行杂交可解决。乙醇：冰醋酸（3：1）虽然广泛用于核酸原位杂交时的组织细胞固定，不过固定后组织细胞内RNA明显减少，但同时本底也很低。由于固定的时间一是一个影响原位杂交的重要因素，因此还必须根据具体实验摸索出适合自己要求的固定液与固定时间。
二．预杂交
核酸原位杂交时，由于组织细胞中的核酸都与细胞内蛋白质结合，以核酸蛋白质复合体的形式存在与细胞浆或细胞核中，固定过程中固定液的交联作用时胞浆或胞核内的各种生物大分子形成网络，影响探针的穿透力，阻碍杂交体的形成。因此，需进行预杂交的过程，其目的是去除核酸表面的蛋白质，屹立与核酸探针对靶核酸进行杂交。常用去垢剂（detergeat）和/或蛋白酶对组织细胞进行部分的消化酶解以去除核酸表面的蛋白质。常用的去垢剂由Triton-X100和十二烷基碘酸钠（SDS），常用的蛋白酶有蛋白酶K等。蛋白酶K的纯度、浓度、消化的时间在不同的组织细胞中相差极大，因此，必须进行一系列的预试验，找到适当的浓度及消化时间。
三、杂交
杂交过程是核酸原位杂交技术的主要环节，包括以下重要内容。
1、探针的选择 核酸原位杂交中所用的探针可以是双链的DNA（dsDNA）也可以是单链的DNA（ssDNA）,或为RNA。近年来人工合成的寡核苷酸也得到了广泛应用。一般而言，标记的DNA或RNA探针都可用于DNA或RNA的定位，其长度为50-300bp（碱基）最好，这个长度范围的探针在组织细胞中的穿透力好，杂交效率高。常用的探针有：
（1）双链DNA探针。常用于杂交的探针之一，可通过切口平移标记或随机引物标记法标记。后者与前者相比，能产生高比活的探针，但标记探针的产量较低，不适合大量切片的原位杂交。
（2）人工合成脱氧寡核苷酸。可由DNA合成仪合成，与克隆的DNA相比，人工合成脱氧寡核苷酸有下列优点：特异性较高，当DNA顺序未知时可按氨基酸顺序进行合成，可用于相似基因顺序差异研究；可用合成的不同顺序探针对特定基因进行最佳杂交条件的筛选；由于分子量小，与相同量的dsDNA探针相对而言，具有高得多的摩尔浓度。
（3）单链cDNA探针。单链cDNA探针常通过克隆载体M13获得。ssDNA探针与dsDNA探针相对比，其最大优点在于，ssDNA探针不会像dsDNA探针那样与自身互补的第二条链复性杂交，增加了探针的有效浓度。
（注：M13是大肠杆菌丝状噬菌体系列中的一个。含有6400个左右的核苷酸单链闭环DNA分子。在用作克隆载体时，可以产生大量含有外源性DNA某一条链的DNA分子。）