十一 金属螯合亲和层析分离蛋白质
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1．学习亲和层析的原理。
2．掌握亲和层析法分离蛋白质的技术与操作。
亲和层析是以普通凝胶作载体，连接上金属离子制成螯合吸附剂，用于分离纯化蛋白质，这样的方法称为金属螯合亲和层析。蛋白质对金属离子具有亲和力是这种方法的理论依据。已知蛋白质中的组氨酸和半胱氨酸残基在接近中性的水溶液中能与镍或铜离子形成比较稳定的络合物，因此，连接上镍或铜离子的载体凝胶可以选择性地吸附含咪唑基和巯基的肽和蛋白质。过渡金属元素镍在较低pH范围时（pH 6-8），有利于选择性地吸附带咪唑基和巯基的肽和蛋白质，在碱性pH时，使吸附更有效，但选择性降低。金属螯合亲和层析行为在很大程度上，由被吸附的肽和蛋白质分子 表面咪唑基和巯基的稠密程度所支配，吲哚基可能也很重要。
本实验室纯化的目的蛋白是用IPTG诱导表达的pGFPuv,该蛋白是和6His融和表达的，含有特定的组氨酸标记物，这种可溶性蛋白质能用金属亲和层析法进行分离，且操作简单，快速，纯化效率高。
【试剂与器材】〈一〉试剂
1. 0.05mol/L EDTA —0.5mol/L ，NaCL溶液100mL
2. 2mol/L NaCL 溶液 50mL
3. 1mol/L NaOH溶液 50mL
4. 0.2mol/L NiSO4溶液 50mL
5. 平衡缓冲液：50mmol/L Tris-HCL，500mmol/L NaCL，pH7.0 500mL
6. Ni2＋ Chelating Sepharose Fast Flow 5－10 mL
7. 重组pGFPuv质粒大肠杆菌工程菌经诱导表达的细胞裂解蛋白样品 20—50ml
8. 洗涤液：50mmol/L咪唑，50mmol/L Tris-HCL，500mmol/L NaC,pH 7.0
9. 洗脱液：300mmol/L咪唑， 50mmol/L Tris-HCL，500mmol/L NaCL.pH7.0
10 20%乙醇溶液50ml
〈二〉器材
1. 1.5cm X 50cm层析柱
2. 蠕动泵
3. 紫外检测仪
4. 自动收集器
5. 伍豪色谱工作站
1. 样品的制备
细胞的培养及荧光蛋白表达看实验十，细胞的破碎及蛋白的收集如下：收集在25 ℃用细胞培养液，8000r/min，离心5min，去上清液，菌体用平衡缓冲液洗涤一次，离心收集菌体，用三分之一（细胞培养液）体积的平衡缓冲液充分悬浮，冰浴下进行高压破菌处理。然后8000r/min。离心30min，取上清液。放冰箱备用。
2. 亲和层析柱的安装
把层析柱固定在铁支架上，上端的柱头拧下，柱下端出口用夹子封闭。加入少量的无离子水，排去下端的空气泡。取出20%乙醇浸泡的螯合凝胶5－10mL到烧杯中，加入少量的无离子水制成糊状，沿着贴紧柱内壁的玻璃棒把糊状凝胶倒进柱内，打开下端的排水口，让亲和凝胶剂随水流自然沉下。亲和层析剂为5—10mL。然后，将上端的柱头拧紧，并将顶端和下端用软管连接封闭备用。
3. 层析系统的安装、调试
（1）蠕动泵的调试：打开背后电源开关，按下start按钮，上下箭头调节流速为15rpm（约2ml/min），将软管充满去离子水。
（2）系统的连接：将蠕动泵的出水管与层析柱上端管相连，层析柱的下端管与紫外检测仪的进样端连接，将紫外检测仪的out端与自动收集器相连。
（3）紫外收集器的调试：打开紫外背后开关，调节灵敏度旋钮（ABS－Range），调节调零旋钮。
（4）自动收集器的设置：打开电源开关，按“复位”键，确定出液管的位置，按“手动”按钮，进行设置，如选择120seconds一管进行收集，按“自动”即开始计时收集。
（5）伍豪色谱工作站的使用方法：点击桌面的“伍豪色谱工作站“图标打开程序，点击左上角的图标，选择A或B通道，点击“▲”即开始采样，采样结束后点击“■”即结束采样，然后载入A或B通道谱图，保存结果，并打印结果。
4. 层析柱的使用前处理：
（1）用5X柱床体积去离子水清洗乙醇封存的Ni 2＋-Chelating Sepharose Fast Flow亲和层析柱，去除乙醇
（2）用2X柱床体积的0.2M NiSO4过柱，注意观察现象
（3） 用10X柱床体积的去离子水清洗，用5X柱床体积平衡缓冲液平衡柱子
5. 上样：
先从20 mL裂解上清液中取出50 µL用于电泳，作为亲和层析分离前上清液中的总蛋白区带对照图谱。然后以每分钟2 mL的流速上层析柱，分部收集流出液，每管3 mL（记录的紫外吸收峰为穿流峰，取最高的一管样品液用作电泳）。平衡缓冲液过层析柱，直到紫外吸收峰不再下降（达到平台期为止）。
6. 洗涤：
用含50 mmol/L咪唑的洗涤缓冲液25 mL冼脱，分部收集洗脱液，每管5 mL，取紫外吸收最高的一管用于电泳。
7. 洗脱：
用含300mmol/L咪唑的洗脱缓冲液10 mL洗脱，自动收集洗脱液。每管收5 mL，当紫外吸收达最高峰时取样用于电泳及Western blotting实验。
8. 层析柱的后处理及封存：
（1）用2X去离子水清洗柱子
（2）用10X0.5M NaCl，50mM EDTA (pH 8.0) 洗去结合的镍离子
（3）用10X去离子水清洗柱子
（4）用10X1M NaOH洗柱，去残留蛋白
（5）用大约10X去离子水清洗柱，去除NaOH，直到pH值低于9
（6）用大约2X柱床体积乙醇过柱，拆除柱子，保存柱料于20％乙醇中
9. 12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测：
分别取50μL穿流峰流出液、50mmol/L咪唑缓冲液洗涤的流出液和300mmol/L咪唑缓冲液洗脱的流出液。外加一个上柱前的样品液和蛋白Marker作比较。进行12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测亲和层析分离纯化的结果。
【注意事项与提示】
1. 不管是装柱还是上样、洗脱，在整个操作过程中，水或溶液面都不能低于凝胶柱平面。否则，凝胶柱会产生气泡，就会影响层析效果。
2. 样品上柱和洗脱过程，其流速都要慢，分离效果才好。
3. 亲和层析剂可回收，经再生可循环使用。该亲和层析剂用20%乙醇浸泡于冰箱保存。
4. 亲和层析柱在再生处理、上样、洗脱过程中其颜色都有明显变化（白、蓝、绿），只要细心操作，样品是否被吸附上去或被洗脱下来？都能观察到从而作出判断。
5. IPTG诱导表达的荧光蛋白经12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果如下：
1为蛋白分子量标准Marker
2为没有表达产物荧光蛋白的细菌总蛋白区带。
3为诱导表达产物的细菌总蛋区带。明显多出一条区带。
4为样品上层析柱时的流出液（穿流峰）蛋白区带。
5、6、7为含300mmol/L咪唑的洗脱缓冲液洗脱出来的荧光蛋白带。
1）细胞的破碎及总蛋白质的收集需半天 。
2）金属螯合亲和层析柱的处理及分离荧光蛋白需半天。
3）12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测需一天，但可在样品上柱层析分离时制备好凝胶，
层析分离完成后即可进行凝胶电泳。
1. 要求提交IPTG诱导表达的荧光蛋白经12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果图；
2. 亲和层析柱在再生处理、上样、洗脱过程中其颜色有何变化？为什么？
3. 要达到好的分离效果要注意哪些问题？
