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溶血空斑试验

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血空斑试验 (plaque forming cell assay , PFC) 是 Jerne 于 1963 年设计的用于体外检查和计数某种抗体形成细胞的一种方法。该方法是将 SRBC 免疫动物,随后取其脾制成淋巴细胞悬液与高浓度的 SRBC 混合后加入琼脂 凝胶中,其中每个释放溶血性抗体的细胞可致敏其周围的 SRBC ,当加入补体时,致敏的 SRBC 被溶解而形成了局部的溶血空斑,每一个空斑代表一个抗体形成细胞。本实验采用玻片法。
 【材料】
 1. 动物,小白鼠,体重 18 — 22g 。
 2. 补体,脉鼠新鲜血清(用前须经 SRBC 吸收: 1ml 压积 SRBC 加 20ml 补体,置 4 ℃ 20 分钟,离心,取上清,用 Hanks 液稀释为 1 : 10 )。
 3 .主要试剂:琼脂(表层基 0.7% ,底层基 1.4% ,用 Hanks 配制)、用 Hanks 配制的 20%SRBC 、 DEAE 葡聚糖溶液(右旋糖酐) (10mg / m1) 。
 4. 载玻片。
 5 .仪器设备 37 ℃ 恒温箱、 解剖 显微镜 。
 【方法】
 1. 小鼠免疫 及脾细胞悬液的制备
 (1) 以 4 × 10 8 / m1SRBC 免疫小鼠, 4 天后取出免疫和对照小鼠的脾。
 (2) 称重后置含冷 Hanks 的培养皿中,将脾在 l00 目不锈钢网上研磨后,再经 200 目不锈钢网过滤,然后将细胞收集于刻度离心管中 ( 将试管置冰浴中 ) 。
 (3) 用 Hanks 悬浮细胞,调细胞浓度到 2 × l0 6 / m1 。
 2 .琼脂凝胶板的制备
 (1) 预热底层琼脂,倒 4ml 于载玻片上,待凝。
 (2) 将底层基载玻片和所有试剂(除脾细胞)预温 40 ℃ 左右。
 (3) 在表层琼脂中加入牛胎血清、右旋糖酐、 20%SRBC 和脾细胞悬液各 0.1ml ,然后倾注入铺有底层基的载玻片上,凝固后于 37 ℃ 孵育 1 小时。然后加 1.0ml 补体,再次孵育 30 分钟。用放大镜或肉眼或显微镜观察溶血空斑,并计数。
 【结果观察】
 将平皿置解剖显微镜下计数空斑数。一般计算 4 块载玻片上的空斑均数,也可分别计数每块载玻片的空斑数,计算出每组动物每 100 万个脾细胞中含空斑形成细胞的平均值 ( 图 8-1) 。
 【注意事项】

 1. 一般选用纯系小鼠。
 2.在加入细胞之前,琼脂平板制备时要使琼脂完全溶解,加入脾细胞时应检查是否充分均匀分布,因一时性的冷激会导致形成小的凝胶灶,造成观察和判断困难。
 3.注意防止琼脂泡沫的出现。
 4 .摘除的脾不宜立即放入冰浴中的液体中,可显著降低空斑计数。

图 8-1 溶血空斑试验
  通过混合检测细胞和抗原致敏羊红细胞来测定抗体形成细胞。通过孵育,围绕羊红细胞的细胞分泌抗体,羊红细胞由抗体包被,然后加入补体,羊红细胞即被裂解。右图显示一个 B 细胞位于空斑中央。
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