溶血空斑试验

相关专题

 

血空斑试验 (plaque forming cell assay ， PFC) 是 Jerne 于 1963 年设计的用于体外检查和计数某种抗体形成细胞的一种方法。该方法是将 SRBC 免疫动物，随后取其脾制成淋巴细胞悬液与高浓度的 SRBC 混合后加入琼脂 凝胶中，其中每个释放溶血性抗体的细胞可致敏其周围的 SRBC ，当加入补体时，致敏的 SRBC 被溶解而形成了局部的溶血空斑，每一个空斑代表一个抗体形成细胞。本实验采用玻片法。
　【材料】
　1. 动物，小白鼠，体重 18 — 22g 。
　2. 补体，脉鼠新鲜血清（用前须经 SRBC 吸收： 1ml 压积 SRBC 加 20ml 补体，置 4 ℃ 20 分钟，离心，取上清，用 Hanks 液稀释为 1 ： 10 ）。
　3 ．主要试剂：琼脂（表层基 0.7% ，底层基 1.4% ，用 Hanks 配制）、用 Hanks 配制的 20%SRBC 、 DEAE 葡聚糖溶液（右旋糖酐） (10mg ／ m1) 。
　4. 载玻片。
　5 ．仪器设备 37 ℃ 恒温箱、 解剖 显微镜 。
　【方法】
　1. 小鼠免疫 及脾细胞悬液的制备
　(1) 以 4 × 10 8 ／ m1SRBC 免疫小鼠， 4 天后取出免疫和对照小鼠的脾。
　(2) 称重后置含冷 Hanks 的培养皿中，将脾在 l00 目不锈钢网上研磨后，再经 200 目不锈钢网过滤，然后将细胞收集于刻度离心管中 ( 将试管置冰浴中 ) 。
　(3) 用 Hanks 悬浮细胞，调细胞浓度到 2 × l0 6 ／ m1 。
　2 ．琼脂凝胶板的制备
　(1) 预热底层琼脂，倒 4ml 于载玻片上，待凝。
　(2) 将底层基载玻片和所有试剂（除脾细胞）预温 40 ℃ 左右。
　(3) 在表层琼脂中加入牛胎血清、右旋糖酐、 20%SRBC 和脾细胞悬液各 0.1ml ，然后倾注入铺有底层基的载玻片上，凝固后于 37 ℃ 孵育 1 小时。然后加 1.0ml 补体，再次孵育 30 分钟。用放大镜或肉眼或显微镜观察溶血空斑，并计数。
　【结果观察】
　将平皿置解剖显微镜下计数空斑数。一般计算 4 块载玻片上的空斑均数，也可分别计数每块载玻片的空斑数，计算出每组动物每 100 万个脾细胞中含空斑形成细胞的平均值 ( 图 8-1) 。
　【注意事项】

　1. 一般选用纯系小鼠。
　2.在加入细胞之前，琼脂平板制备时要使琼脂完全溶解，加入脾细胞时应检查是否充分均匀分布，因一时性的冷激会导致形成小的凝胶灶，造成观察和判断困难。
　3.注意防止琼脂泡沫的出现。
　4 ．摘除的脾不宜立即放入冰浴中的液体中，可显著降低空斑计数。

图 8-1 溶血空斑试验
　　通过混合检测细胞和抗原致敏羊红细胞来测定抗体形成细胞。通过孵育，围绕羊红细胞的细胞分泌抗体，羊红细胞由抗体包被，然后加入补体，羊红细胞即被裂解。右图显示一个 B 细胞位于空斑中央。