溶血空斑试验
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血空斑试验 (plaque forming cell assay , PFC) 是 Jerne 于 1963 年设计的用于体外检查和计数某种抗体形成细胞的一种方法。
该方法是将 SRBC 免疫动物,随后取其脾制成淋巴细胞悬液与高浓度的 SRBC 混合后加入琼脂凝胶中,其中每个释放溶血性抗体的细胞可致敏其周围的 SRBC ,当加入补体时,致敏的 SRBC 被溶解而形成了局部的溶血空斑,每一个空斑代表一个抗体形成细胞。本实验采用玻片法。
【材料】
1. 动物,小白鼠,体重 18 — 22g 。
2. 补体,脉鼠新鲜血清(用前须经 SRBC 吸收: 1ml 压积 SRBC 加 20ml 补体,置 4 ℃ 20 分钟,离心,取上清,用 Hanks 液稀释为 1 : 10 )。
3 .主要试剂:琼脂(表层基 0.7% ,底层基 1.4% ,用 Hanks 配制)、用 Hanks 配制的 20%SRBC 、 DEAE 葡聚糖溶液(右旋糖酐) (10mg / m1) 。
4. 载玻片。
5 .仪器设备 37 ℃ 恒温箱、 解剖 显微镜 。
【方法】
1. 小鼠免疫及脾细胞悬液的制备
(1) 以 4 × 10 8 / m1SRBC 免疫小鼠, 4 天后取出免疫和对照小鼠的脾。
(2) 称重后置含冷 Hanks 的培养皿中,将脾在 l00 目不锈钢网上研磨后,再经 200 目不锈钢网过滤,然后将细胞收集于刻度离心管中 ( 将试管置冰浴中 )
(3) 用 Hanks 悬浮细胞,调细胞浓度到 2 × l0 6 / m1 。
2 .琼脂凝胶板的制备
(1) 预热底层琼脂,倒 4ml 于载玻片上,待凝。
(2) 将底层基载玻片和所有试剂(除脾细胞)预温 40 ℃ 左右。
(3) 在表层琼脂中加入牛胎血清、右旋糖酐、 20%SRBC 和脾细胞悬液各 0.1ml ,然后倾注入铺有底层基的载玻片上,凝固后于 37 ℃ 孵育 1 小时。然后加 1.0ml 补体,再次孵育 30 分钟。用放大镜或肉眼或显微镜观察溶血空斑,并计数。
【结果观察】 免疫学实验技术论坛
将平皿置 解剖显微镜 下计数空斑数。一般计算 4 块载玻片上的空斑均数,也可分别计数每块载玻片的空斑数,计算出每组动物每 100 万个脾细胞中含空斑形成细胞的平均值 。
1. 一般选用纯系小鼠。
2.在加入细胞之前, 琼脂 平板制备时要使 琼脂 完全溶解,加入脾细胞时应检查是否充分均匀分布,因一时性的冷激会导致形成小的凝胶灶,造成观察和判断困难。
3.注意防止琼脂泡沫的出现。
4 .摘除的脾不宜立即放入冰浴中的液体中,可显著降低空斑计数。