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非标记抗体免疫电镜的操作步骤

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1.经典法 (1)将被检病毒材料0.9ml,加1︰5~1︰10稀释的特异性免疫 血清0.1ml充分混合。(2)置37℃作用1h或37℃1h后再置4℃过夜。(3)以17 000r/min~23 000r/min离心90min。(4)吸去上清,将离心管口倒置于滤纸上,吸去残留液体。(5)沉淀物中加少量H2O混悬,用3%磷钨酸(pH6.0)负染20Sec~30Sec,滴加于400目铜网Fomnvar膜上,用滤纸从铜网边缘轻轻吸去多余的负染液。(6)在透射电镜下4×104倍观察。
2.快速法(琼脂 扩散法) (1)同经典法(1)、(2)步骤,制备免疫复合物。(2)以生理盐水或pH 7.2巴比妥缓冲液制备1%琼脂糖,趁热浇注于洁净的载玻片上,每片3ml,待冷却凝固后,在凝胶面上等距离放置直径4mm玻璃珠数粒,再于凝胶面上浇注1%琼脂糖2ml~3ml,冷却凝固后,取出玻璃珠,使凝胶形成凹孔。(3)将普通滤纸剪成2×3cm大小,3~4层重叠。用小刀将带有凹孔的琼脂糖切成小块,每块带有一个凹孔,平放在滤纸上。(4)在凹孔内,加入制备好的含病毒的免疫复合物悬液。(5)将电镜载网的Fomnvar膜面向下倒悬于液滴上。由于琼脂糖的吸水作用,20min~30min后,可将液滴的水分吸干,而浓缩的免疫复合物则粘附在载网膜上。(6)在载网膜上滴加3%磷钨酸负染20Sec,过量的负染液用滤纸在载网边缘轻轻吸去。(7)于透射电镜4×104倍下观察。

 

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