非标记抗体免疫电镜的操作步骤

互联网2013-07-08

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1．经典法

（1）将被检病毒材料0.9ml，加1︰5～1︰10稀释的特异性免疫血清0.1ml充分混合。

（2）置37℃作用1h或37℃1h后再置4℃过夜。

（3）以17 000r/min～23 000r/min离心90min。

（4）吸去上清，将离心管口倒置于滤纸上，吸去残留液体。

（5）沉淀物中加少量H ₂ O混悬，用3%磷钨酸(pH6.0)负染20Sec～30Sec，滴加于400目铜网Fomnvar膜上，用滤纸从铜网边缘轻轻吸去多余的负染液。

（6）在透射电镜下4×10 ⁴ 倍观察。
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2．快速法( 琼脂扩散法)

（1）同经典法(1)、(2)步骤，制备免疫复合物。

（2）以生理盐水或pH 7.2巴比妥缓冲液制备1% 琼脂糖，趁热浇注于洁净的载玻片上，每片3ml，待冷却凝固后，在凝胶面上等距离放置直径4mm玻璃珠数粒，再于凝胶面上浇注1%琼脂糖2ml～3ml，冷却凝固后，取出玻璃珠，使凝胶形成凹孔。

（3）将普通滤纸剪成2×3cm大小，3～4层重叠。用小刀将带有凹孔的琼脂糖切成小块,每块带有一个凹孔,平放在滤纸上。

（4）在凹孔内，加入制备好的含病毒的免疫复合物悬液。

（5）将电镜载网的Fomnvar膜面向下倒悬于液滴上。由于琼脂糖的吸水作用，20min～30min后，可将液滴的水分吸干，而浓缩的免疫复合物则粘附在载网膜上。

（6）在载网膜上滴加3%磷钨酸负染20Sec，过量的负染液用滤纸在载网边缘轻轻吸去。

（7）于透射电镜4×10 ⁴ 倍下观察。