HLA分型技术回顾

相关专题

 

主要组织相容性复合物（MHC）是脊椎动物体内最复杂且具有高度多态性的基因群。1984年George Snell 首次发现小鼠MHC即H－2，1958年Dausset 发现了人的MHC即HLA基因。MHC的表达产物称为主要组织相容性抗原 ，MHC抗原是有核细胞表面膜蛋白分子，对抗原递呈和免疫信号传递起关键作用。
HLA基因，位于6号染色体 上短臂上，长约4000Kb。HLA是目前所知人体最复杂的遗传多态性系统，有几十个基因座位，每个基因座位又有几十个等位基因，且呈共显性表达。由于MHC基因位于同一条染色体上，其多基因座位上的基因型组合相对稳定，很少发生同源染色体间交换，这就构成了以单元型（HAPLOTYPE，即在同一条染色体上紧密连锁的一系列等位基因的特殊组合）为特征的遗传。按中国人常见的A座位基因有13个，B座位基因有30个计算，可组成的单元型约有13×30＝390种之多。理论上估计，父母各给一串单元型给子女，便会形成4.3万种HLA－AB血型。事实上，HLA 各基因并非完全随机地组成单元型，而是呈现出连锁不平衡（linkage disequilibrium,LD）的特点。理论推测的HLA 分型数量巨大，但对一个具体的民族来说并非如此。世界上各个民族人群的HLA多态性和单元型都有各自的特点。总体来讲，中国北方汉族、北美白人和北美黑人人群的多态性较中国南方汉族和日本人群丰富。即使在中国，地区间也存在差异。在中国汉族群体中抗原A1、A3、B13、B44和B51频率呈北高南低分布，而抗原A24、B46、B60呈北低南高分布。在中国汉族群体中常见的A30-B13-DRBundefined07，A1-B37-DRBundefined10单体型频率呈北高南低分布，在江浙沪汉族人群中频率较北方汉族人群下降，而A2-B46-DRBundefined09，A33-B58-DRBundefined17，A33-B58-DRBundefined13单体型频率呈北低南高分布。HLA多态性程度可见一斑。
　　HLA研究涉及免疫学 、生物学、遗传学、分子生物学、医学等多个学科，并已发展成为一个独立的学科分支。迄今HLA研究已达到相当深入的水平，并在诸多方面取得显著进展，包括HLA复合体结构；HLA分子结构及其表达的调控；HLA分子功能，尤其是在抗原处理、呈递及T细胞识别中的作用；HLA的DNA分型及多态性研究；HLA与疾病的关系；HLA与移植的关系等。HLA研究不仅使器官移植成为一种极有价值的治疗手段，并给基础与临床免疫带来了突破性进展。已经证实，HLA复合体中存在控制免疫应答的基因以及HLA参与约束免疫细胞间相互作用，这表示HLA涉及生命活动的各个水平与多个方面。可以预期，对HLA的研究将继续成为免疫遗传学最活跃的部分；对HLA的应用将扩展到基础、临床、预防医学的各个领域。
　　纵观HLA系统的研究过程，其发展无不与技术的手段的突破与运用有密切关系。70年代到80年代末期主要是血清学研究；90年代以来，HLA进入了分子水平研究阶段，进展尤为显著。HLA分型技术同样走过了这一历程。建立于60年代并不断完善的血清学及细胞学分型技术主要侧重于分析HLA产物特异性。
　　血清学分型借助的是微量淋巴细胞毒试验（microlymphocytotoxicitytest）或称补体依赖的细胞毒试验（complement dependent cytotoxicity test，CDC）。取已知HLA抗血清加入待测外周血淋巴细胞，作用后加入兔补体，充分作用后加入染料，，着染的细胞为死亡细胞，依据特异性抗体介导的补体系统对靶细胞溶解的原理，待检淋巴细胞表面具有已知抗血清所针对的抗原。血清学分型存在诸多缺点：①标准分型抗体亲和力较弱、效价较低、易产生交叉反应，②缺少某些单价抗血清；③某些病理过程可能导致外周血淋巴细胞表面抗原性质发生改变．干扰抗原—抗体反应；④国内供HLA—I类抗原分型的血清板来源困难、质量欠佳。上述因素均严重影响了HLA分型结果的可靠性及该技术的推广应用。
　　细胞学分型技术指的是通过纯合分型细胞（homozygote typing cell,HTC）及预致敏淋巴细胞试验（primed lymphocyte test,PLT）对HLA分型。二种方法的基本原理均是判断淋巴细胞在识别非己HLA抗原决定簇后发生的增殖反应。由于分型细胞来源困难以及操作手续繁琐，细胞学分型技术下正逐渐淘汰。
1991年第11届国际HLA专题讨论上提出了HLA的DNA分型方法，这类方法近年来在研究和应用方面发展非常快，有取代其他方法的趋势。DNA分型方法主要分为两种：基于核酸序列识别的方法和基于序列分子构型的方法。下面简要的阐述各方法的原理和优缺点。
　　基于核酸序列识别的方法主要有：PCR-RFLP,PCR-SSO,PCR-SSP和PCR-SBT。
　　PCR-RFLP：其原理是将目的基因片段PCR扩增后，利用多种限制性内切酶对扩增产物进行酶切，不同的基因序列会产生不同的酶切产物，从而产生不同的电泳图谱。它以其简单、敏感、准确，无需同位素等优点成为目前较常用的HLA基因分型技术之一，但是无法分辨杂合子，且只能区分有限的多态性。