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HLA分型技术回顾

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HLA基因,位于6号染色体上短臂上,长约4000Kb。HLA是目前所知人体最复杂的遗传多态性系统,有几十个基因座位,每个基因座位又有几十个等位基因,且呈共显性表达。由于MHC基因位于同一条染色体上,其多基因座位上的基因型组合相对稳定,很少发生同源染色体间交换,这就构成了以单元型(HAPLOTYPE,即在同一条染色体上紧密连锁的一系列等位基因的特殊组合)为特征的遗传。按中国人常见的A座位基因有13个,B座位基因有30个计算,可组成的单元型约有13×30=390种之多。理论上估计,父母各给一串单元型给子女,便会形成4.3万种HLA-AB血型。事实上,HLA 各基因并非完全随机地组成单元型,而是呈现出连锁不平衡(linkage disequilibrium,LD)的特点。理论推测的HLA 分型数量巨大,但对一个具体的民族来说并非如此。世界上各个民族人群的HLA多态性和单元型都有各自的特点。总体来讲,中国北方汉族、北美白人和北美黑人人群的多态性较中国南方汉族和日本人群丰富。即使在中国,地区间也存在差异。在中国汉族群体中抗原A1、A3、B13、B44和B51频率呈北高南低分布,而抗原A24、B46、B60呈北低南高分布。在中国汉族群体中常见的A30-B13-DRBundefined07,A1-B37-DRBundefined10单体型频率呈北高南低分布,在江浙沪汉族人群中频率较北方汉族人群下降,而A2-B46-DRBundefined09,A33-B58-DRBundefined17,A33-B58-DRBundefined13单体型频率呈北低南高分布。HLA多态性程度可见一斑。
  HLA研究涉及免疫学、生物学、遗传学、分子生物学、医学等多个学科,并已发展成为一个独立的学科分支。迄今HLA研究已达到相当深入的水平,并在诸多方面取得显著进展,包括HLA复合体结构;HLA分子结构及其表达的调控;HLA分子功能,尤其是在抗原处理、呈递及T细胞识别中的作用;HLA的DNA分型及多态性研究;HLA与疾病的关系;HLA与移植的关系等。HLA研究不仅使器官移植成为一种极有价值的治疗手段,并给基础与临床免疫带来了突破性进展。已经证实,HLA复合体中存在控制免疫应答的基因以及HLA参与约束免疫细胞间相互作用,这表示HLA涉及生命活动的各个水平与多个方面。可以预期,对HLA的研究将继续成为免疫遗传学最活跃的部分;对HLA的应用将扩展到基础、临床、预防医学的各个领域。
  纵观HLA系统的研究过程,其发展无不与技术的手段的突破与运用有密切关系。70年代到80年代末期主要是血清学研究;90年代以来,HLA进入了分子水平研究阶段,进展尤为显著。HLA分型技术同样走过了这一历程。建立于60年代并不断完善的血清学及细胞学分型技术主要侧重于分析HLA产物特异性。
  血清学分型借助的是微量淋巴细胞毒试验(microlymphocytotoxicitytest)或称补体依赖的细胞毒试验(complement dependent cytotoxicity test,CDC)。取已知HLA抗血清加入待测外周血淋巴细胞,作用后加入兔补体,充分作用后加入染料,,着染的细胞为死亡细胞,依据特异性抗体介导的补体系统对靶细胞溶解的原理,待检淋巴细胞表面具有已知抗血清所针对的抗原。血清学分型存在诸多缺点:①标准分型抗体亲和力较弱、效价较低、易产生交叉反应,②缺少某些单价抗血清;③某些病理过程可能导致外周血淋巴细胞表面抗原性质发生改变.干扰抗原—抗体反应;④国内供HLA—I类抗原分型的血清板来源困难、质量欠佳。上述因素均严重影响了HLA分型结果的可靠性及该技术的推广应用。
  细胞学分型技术指的是通过纯合分型细胞(homozygote typing cell,HTC)及预致敏淋巴细胞试验(primed lymphocyte test,PLT)对HLA分型。二种方法的基本原理均是判断淋巴细胞在识别非己HLA抗原决定簇后发生的增殖反应。由于分型细胞来源困难以及操作手续繁琐,细胞学分型技术下正逐渐淘汰。
1991年第11届国际HLA专题讨论上提出了HLA的DNA分型方法,这类方法近年来在研究和应用方面发展非常快,有取代其他方法的趋势。DNA分型方法主要分为两种:基于核酸序列识别的方法和基于序列分子构型的方法。下面简要的阐述各方法的原理和优缺点。
  基于核酸序列识别的方法主要有:PCR-RFLP,PCR-SSO,PCR-SSP和PCR-SBT。
  PCR-RFLP:其原理是将目的基因片段PCR扩增后,利用多种限制性内切酶对扩增产物进行酶切,不同的基因序列会产生不同的酶切产物,从而产生不同的电泳图谱。它以其简单、敏感、准确,无需同位素等优点成为目前较常用的HLA基因分型技术之一,但是无法分辨杂合子,且只能区分有限的多态性。

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