有关细胞和组织学技术

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一、细胞和组织

　　免疫组织化学技术是用标记物或显色物标记的抗体检测细胞和组织内的抗原 ，从而达到诊断和研究疾病的目的。抗原的准确显示和定位与制备的细胞和组织标本质量的好坏有着密切的联系。由于各种抗原的生化、物理性质不同，如温度高低、酸碱度强弱及各种化学试剂的作用均可影响抗原的免疫学活性，良好的细胞和组织学结构将有助于抗原的准确定位。因此，细胞和组织标本的采集制备在免疫组织化学技术中占有十分重要的位置。

　　（一）细胞标本的取材

　　目前，免疫组化 技术已经应用于细胞学诊断，如鉴别低分化癌与恶性淋巴瘤、黑色素瘤、低分化肉瘤等。CEA应用于胸腹水中间皮瘤与癌的鉴别。McAb应用于淋巴白血病和恶性淋巴瘤的分类分型。近年来，培养细胞的免疫组化技术在鉴定细胞的种类、分化程度、表面抗原特点以及肿瘤结构成分改变等方面的研究均起到了积极作用。

　　细胞标本的取材有以下3种方法:

　　1．印片法　　主要应用于活组织检查标本和手术切除标本。新鲜标本以最大面积剖开，充分暴露病变区，将载玻片轻轻压于病变区，脱落的细胞便粘附在玻片上，立即浸入细胞固定液内5-10min，取出后自然干燥，低温保存备用。

　　优点是简便省时，细胞抗原保存较好。缺点是细胞分布不均匀，玻片上细胞重叠，影响标记效果。

　　2．穿刺吸取涂片法　　主要应用于实质器官的病变区，如肝、肾、肺、淋巴结、软组织等。用细针穿刺吸取病变区内液体成分，如穿刺液较少，可直接涂抹在载玻片上，力求细胞分布均匀。如穿刺液较多，细胞丰富，可用洗涤法：将穿刺液滴入盛有1-2ml Hanks液（RPMi 1640液）的试管内，轻轻搅拌，以500rpm低速离心5-10min后，弃上清液，将沉淀制成细胞悬液（浓度约2×106细胞/ml），吸取1滴于载玻片上，轻轻涂抹，待涂片略干即可固定。

　　该法穿刺吸取直接涂片的优点是操作简便，细胞形态保持较好。缺点是细胞分布不均匀。洗涂法片虽可弥补这一缺点，但操作复杂，细胞常常发生变形。

　　3．体液沉淀涂片法　　主要用于胸水、腹水、尿液、脑脊液等体液多、细胞少的标本。体液采取后，必须及时处理，更不宜加固定液。根据标本内细胞数量的多少选用不同的处理方法：①细胞数量极多者，可吸取少量液体直接涂在玻片上。②细胞数量较少者，可将液体自然沉淀，然后吸取5ml左右沉淀液，以1500rpm离心10min，弃上清液，将沉淀涂片，略干后固定备用。

　　如用细胞离心涂片器(Cytospin )，可将标本用上述离心沉淀法制成2×106细胞/ml的细胞悬液，吸取50μl加入涂片器内，离心后即制成分布均匀的细胞涂片，细胞分布在直径约6mm的小圆圈内，每个圆圈内的细胞数约105个(Danos,1976)。

　　培养细胞标本的取材可根据培养的细胞特性分别采取不同的方法。某些细胞有贴壁生长的特性，如纤维母细胞、粘液癌细胞等，只需将载玻片或盖玻片插入培养液内即可收集到理想的细胞标本。某些细胞只能在培养液中生长，可用上述体液沉淀离心涂片法处理。

　　制备细胞涂片应注意：①标本反复离心洗涤，细胞的粘附性降低，在免疫 组化染色过程中容易脱片，因此，在制备涂片前载玻片上应涂粘附剂。②为节　省试剂和便于镜下观察和记数，应将细胞集中到直径0.6-1.0cm的圆圈内，细胞总数以105个为宜。③粘液丰富的标本，如痰液，胃液等，未经特殊处理，一般不宜作免疫组化标记。

　　（二）组织标本的取材

　　组织标本主要取之于活组织检查标本、手术切除标本、动物模型标本以及尸体解剖标本等。前三者均为新鲜组织，后者是机体死亡2h以上的组织，可能有不同程度的自溶，其抗原可能有变性消失，严重弥散现象，因此，尸检组织应尽快固定处理，以免影响免疫组化标记效果。但有些较稳定性抗原，如HBsAg、HBcAg等在尸检标本中，抗原显示仍较好。

　　组织标本的取材常常受到各种因素的影响，如各种内窥镜钳取的组织，常因过度挤压而变形，严重者组织结构被破坏。大组织标本病变分布广泛，抗原在组织中分布不均一，常出现人为的组织取材不准确。为了避免上述缺点，组织取材时应注意：①活检钳的刃口必须锋利，以免组织受挤压；②取材部位必须是主要病变区；③必须取病灶与正常组织交界区；④必要时取远距病灶区的正常组织作对照。

　　为充分保存组织的抗原性，标本离体后庆立即作处理，或立即速冻成冻块进行冰冻切片，或立即用固定液固定进行脱水、浸蜡、包埋、石蜡切片。如不能迅速制片，可贮存于液氮罐内或-70。C冰箱内备用。