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单克隆抗体细胞的选择

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(一)脾细胞 1.材料(1) 免疫 过的血清抗体滴度高的Balb/c鼠。(2)1640培养液(3)2.5%FCS-1640营养液2.操作方法(1) 拉颈或用CO2处死小白鼠。(2将小鼠放于70%酒精中浸泡消毒,取出固定于板上,在无菌条件下取脾。(3)把脾放入5ml含有2.5%FCS的1640液中,冰浴下轻轻洗去脾上的红血球。(4)用镊子轻轻挤压脾,做成脾细胞悬液,用毛细管将悬液移入小试管中。(5)直立小试管3min,使大块的结缔组织下沉,把细胞悬液移入离心管中。(6)以2.5%FCS—1640充满离心管,并以400g离心7min~10min(与此同时应开始制备骨髓细胞)。(7)把沉淀用约10ml的新鲜培养液再悬浮。(8)重复⑹、⑺步骤。(9)计算细胞,以台盼兰染色用相差显微镜检查,活细胞数应高于80%为合格。
(二)骨髓瘤细胞 骨髓瘤细胞能产生并分泌大量的免疫球蛋白,这样的瘤细胞融合后,可能影响或降低所分泌抗体的滴度,所以必须选育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤细胞。选择骨髓瘤细胞的条件:①该瘤细胞系的来源应与制备脾细胞小鼠为同一品系,以便两者的组织相容性抗原 一致;②骨髓瘤细胞必须是静息状态,不产生γ球蛋白或不分泌到细胞外;③骨髓瘤细胞生长需要一个较高的细胞密度,最好106个细胞/ml;④生长速度快,繁殖时间短。目前常用的Balb/c小鼠产生的骨髓瘤细胞株有:①S194/5XXO·BU·1;②SP2/0—Ag14(简称SP2);③P2—X? ­—Ag8·6·5·3(简称653);④FO以653最为常用,它是由矿物油4-甲基-15烷(Pristane,降植烷)诱发出来的一种浆细胞瘤(Minerol Oil plasmacy toma,MOPC)并经过培育形成一株8-氮鸟嘌呤有抵抗力的亚系。骨髓瘤细胞一般由有关单位直接引入,保存于-195℃液氮罐中,试验时复苏、增殖、传代即可。由于骨髓瘤细胞是半贴壁状态,很容易脱落,因此不需要胰酶处理。为了防止出现返祖现象,在融合前,可将培养基内加入15μg/ml 8-氮鸟嘌呤。取约1×107~6×107对数生长期(即培养15h~20h)的骨髓瘤细胞,在室温离心(400g)10min,沉淀以2.5%FCS—1640液再悬浮并计数。
(三)饲养细胞 在体外的细胞培养 中,单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖,必须加入其它活的细胞才能使其生长繁殖,加入的细胞称之为饲养细胞(Feeder cell)。在细胞融合和单克隆的选择过程中,就是在少量的或单个细胞的基础上使其生长繁殖成群体,因此在这一过程中必须使用饲养细胞。许多种类的动物细胞都可以做饲养细胞,如正常的脾细胞、胸腺细胞、腹腔渗出细胞等,常选用腹腔渗出细胞,其中主要是巨噬细胞和淋巴细胞。应用腹腔渗出细胞的好处是:一方面做饲养细胞,另一方面巨噬细胞可以吞噬死亡的细胞和细胞碎片,为融合细胞的生长造成良好的环境。腹腔细胞的来源可以是与骨髓瘤细胞同系鼠。也可以是其他种类的小鼠,如C57鼠,昆明小白鼠等。1.材料(1)小鼠(Balb/c或C57小白鼠)若干只。(2)11.6%蔗糖溶液(经10磅30min高压灭菌)。2.操作方法(1)拉颈处死小鼠。(2)70%酒精浸泡消毒10min。(3)用手术剪将小鼠腹部剪开一小口,剥开皮肤,露出腹腔。(4)用注射器将4ml 11.6%蔗糖溶液注入腹腔,用手指轻揉1min仍用该注射器回抽腹腔液体,加入离心管。(5)1 000r/min离心10min。(6)取上清,以HAT选择培养液将细胞制成悬液。台盼蓝染色计数活细胞,使每毫升含40万个活细胞。(7)以1ml吸管将细胞种入微量培养皿,每孔0.05ml,含2万个细胞,放入CO2培养箱培养,即可供细胞融合和克隆化之用。如果在融合后发现在培养孔中饲养细胞数量少,则可以在细胞换液时再加入一些。
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