杂交瘤细胞的制备

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1） 瘤细胞培养 （无特殊要求）
骨髓瘤细胞呈悬浮或轻微附着形式生长，如附着性生长的细胞多时，用吸管轻轻吹打或轻轻叩击培养容器即可分离下来。通常要维持细胞于指数生长期（细胞培养时间为15~20小时），每3~5天取细胞0.2~1ml移入到10ml新培养液中，其最大细胞密度不能超过5×105~106/ml。一般使用含有高糖的DMEM 培养液，并补加有pH的稳定剂HEPES。

2）免疫 小鼠和脾细胞的制备
免疫：取6~8周龄Balb/C雌鼠，基础免疫2周，静脉再加强免疫一次，3~5天后用于融合。
脾细胞制备：
1．引颈处死小鼠，用酒精消毒表体。
2．无菌条件下取出脾脏，剃除结缔组织和脂肪，用5ml无血清培养液冲洗一次。
3．把脾脏置于已消毒的90~100目不锈钢网或尼龙纱网中。
4．在脾中部切开一小口，用注射器芯从一端轻轻压挤，再用无血清培养液冲洗，令细胞通过纱网，收集入平皿中，或用注射器向脾脏内注入3 ml无血清培养液，反复抽吸数次方法获取细胞，再制成细胞悬液亦可。
5．把细胞悬液注入50ml离心管中，加10~20ml培养液，轻轻吹打数次，室温中置5分钟。
6．离心（800~1000转/分）计数，备用。

3）饲细胞的制备：常用小鼠胸腺细胞或小鼠的腹腔细胞
小鼠腹腔细胞制备方法：
1．引颈处死小鼠，用酒精消毒表体。
2．切开腹部皮肤剥向两侧，暴露出腹壁。
3．用无菌7号针头注射器，吸取3ml无血清培养液。
4．用小镊夹起腹壁，注入3ml无血清培养液，用手反复轻轻揉腹壁，再反复抽吸3~5次。
5．收集末次吸得的细胞，注入50ml的离心管中，再加20ml无血清培养液，用吸管漂洗一次。
6．离心，去上清，用含血清培养基调节细胞浓度为2×105/ml，接种入培养板中，24孔板每孔加0.1ml。
4）细胞融合
HAT培养基的制备