杂交瘤细胞的染色体分析实验

杂交瘤细胞的染色体分析实验目的是为了明确杂交瘤细胞染色体的变化。 正常小鼠脾细胞有 40 条染色体， 且全部为端着丝点染色体 （telocentric chromosome）； 小鼠骨髓瘤细胞染色体数目变异较大， 如 SP2/0 细胞为 62－68 条，NS－1 细胞为 54－64 条， 大多数为非整倍性， 且有中部着丝点染色体 （metacentricchromosome） 和亚中部着丝点染色体 （submetacentricchromosome） 等标志染色体。

当小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合后， 通过 HAT 培养液的选择性培养， 得到的杂交瘤细胞染色体应反映出两种亲本细胞的染色体特点， 一是在数量上接近两种亲本细胞染色体数目的总和， 二是在结构上除多数为端着丝点染色体外， 还应出现少数中部着丝点等标志染色体。 种内甚至同系的杂交瘤细胞虽比较稳定， 但在反复传代培养过程中也会不断丢失染色体。 当杂交瘤细胞一旦丢失携带抗体产生基因的染色体时， 其分泌抗体的能力就会消失。

因此， 对杂交瘤细胞进行染色体分析， 不仅可作为鉴定其是否为真正杂交瘤细胞的客观指标之一， 而且对了解杂交瘤细胞株分泌 McAb 的能力也有一定意义。

器材：离心管、离心机、恒温水浴锅、超净台、显微镜。

试剂：

① 20％FCS－RPMI 1640 培养液。

② 秋水仙素溶液：称取 10 mg 秋水仙素，溶于 100 ml 生理盐水中（即为 100 μg/ml），过滤除菌后分装，－20℃ 冻存备用。

③ 低渗液：0.075mol/L 的 KCl 溶液。

④ 固定液：取甲醇 3 份，冰醋酸 1 份，混匀即成（临用前新鲜配制）。

⑤ Giemsa 染液原液：称取 Giemsa 粉末 0.5 g，溶于 33 ml 甘油中（可先在研钵内加入少量甘油与 Giemsa 粉混合，研磨直至无颗粒为止，再将剩余甘油倒入），55-60℃ 保温 2 小时后，加入 33 ml 甲醇混匀，保存于棕色瓶内备用。

⑥ Giemsa 工作液：取 Giemsa 染液原液 1 份，加 0.15mol/L、pH6.8 的磷酸缓冲液 9 份，混匀即成（临用前新鲜配制）。

杂交瘤细胞的染色体分析实验的基本过程可分为如下几步：

（1）培养细胞

A 在加秋水仙素前 36 - 48 小时将杂交瘤细胞传代（实验时杂交瘤细胞可生长至对数期）。

（2）秋水仙素处理

A 终止培养前 4 - 6 小时，在培养的杂交瘤细胞中加入秋水仙素，使最终浓度为 0.1 - 0.4 μg/ml；如使用秋水仙胺则最终浓度为 0.02 - 0.05 μg/ml。

B 培养结束后，收集细胞于离心管中，以上步骤均需无菌操作。

（3）染色体制备

A 离心：1000 r/min 离心 10 分钟，弃去上清液。

B 低渗处理：加入预热到 37℃ 的 0.075 mol/L KC1 低渗液 5 ml，轻轻悬浮细胞沉淀并混匀，置 37℃ 恒温水浴 15-20 分钟。

C 预固定：向悬液中加入新配制的固定液 1 ml，混匀（使细胞表面先轻微固定，能防止固定后细胞粘连成团块），1000 r/min 离心 10 分钟，弃去上清液。

D 固定：加入固定液 5 ml，重悬细胞沉淀并混匀，室温静置 20-30 分钟，1000 r/min 离心 10 分钟，弃去上清液。

E 再固定：操作同上。

F 制悬液：视细胞数量多少加入 0.3-0.5 ml 固定液，制成细胞悬液。

G 滴片：用滴管吸取细胞悬液 1-2 滴，滴在刚从冰水中取出的载玻片上，立即吹散，并在酒精灯火焰上通过数次，使细胞平铺于载玻片上，空气中自然干燥。

（4）染色

A 用新配制的 Giemsa 工作液染色 10 - 20 分钟，然后用自来水洗去染液，空气中自然干燥。

（5）镜下观察

A 低倍镜下寻找分散良好、染色适中的分裂象，油镜下观察染色体形态并计数。每份标本应计数 100 个完整的中期核细胞，记录染色体数目后列成表格，分析染色体数目的分布，并注意观察是否有标志染色体。

1. 秋水仙素处理时间过长，分裂细胞多，染色体短小；反之，则分裂细胞少而染色体细长，都不宜观察形态及计数，故秋水仙素的浓度及作用时间要准确掌握。

2. 低渗液浓度及处理时间要适当，且低渗处理后混匀细胞一定要轻柔，否则易引起细胞膜破裂、染色体散失。

3. 固定液应在使用前临时配制，否则有机溶剂挥发，将无法有效固定细胞。

4. 载玻片一定要彻底洗净，勿留任何油脂，否则染色体分散不好。