荧光原位杂交的染色体分析

 

荧光原位杂交的染色体分析

 

（一）标本的制备

 

1． 室温下，依次用 70 ％、 90 ％和 100 ％的乙醇脱水 5min 。

2． 空气干燥载玻片。

3． 若短期使用，载玻片可在室温贮存数天。若载玻片要长期保存，应在室温下过夜使组织“老化”（ aged ），然后放入容器中，该容器密封于含干燥剂的塑料袋内，－ 70 ℃保存。根据作者的经验，在 6 个月内使用的载玻片可贮存在－ 20 ℃。在杂交实验之前解冻这些载玻片，不提倡反复冻融载玻片。

 

 

（二）缺口平移法标记探针

 

通过缺口平移法生物素（酰）化 DNA 探针

1． 结合： 2 μ g 探针 DNA ， 10 μ l 10 ×反应缓冲液， 10 μ l β－巯基乙醇， 10 μ l 核苷酸母液（含 0.5mmol/L dATP, 0.5mmol/L dCTP, 0.5mmol/L dGTP, 0.5mmol/L 生物素 -16-dUTP 和 0.12mmol/L dTTP ）， 20 单位 DNA 聚合酶 I 和 1 ： 1000 稀释的 DNase I ，加双蒸水至 100 μ l （最后加酶）。

2． 在 15 ℃温育 2h 。

3． 置反应混合物于冰浴直至反应产物的大小被确定。

4． 凝胶电泳检测探针分子的长度：取 10 μ l 反应混合物，加入凝胶上样缓冲液，水浴箱中煮沸 2 ～ 3 分钟使其变性，冰浴 3min ，上样到 1 ～ 2 ％的琼脂糖微型凝胶中，并以适当大小的标准品做对照，以 50V/cm 电泳 3min 。用浓度为 0.5 μ g/ml 的溴化乙锭染胶，在紫外透照仪上显示 DNA 并拍照。

5． 对于最佳的杂交条件，探针（可见一脱尾）应为 100 ～ 500nt 。根据电泳结果进行下述步骤：

a.       如果探针大小在期望的范围内，进行步骤 6 。

b.      如果探针太大，可加入更多的 DNase I ，在 15 ℃温育。

c.       如果探针未完全消化，纯化探针并重复缺口平移法。

d.      如果探针太短，用较少的 DNase 重复反应。

6． 为使 DNase 失活，加入 2 μ l 0.5mol/L EDTA 和 1 μ l SDS ，在 68 ℃加热 10min 。

7． 用离心柱凝胶过滤法从标记的探针中分离出未掺入的核苷酸：

a.       用 1ml 注射器装入硅胶玻璃棉至 0.2ml 刻度处，加经缓冲液平衡的 Sephadex G50 至 1ml 刻度处，将此柱置 15ml 的离心管内，室温下， 3000r/min 离心 6min 。

b.      去除过柱后的液体，加入缓冲液重复离心直至柱内容物紧密充填至 1ml 刻度处，加 100 μ l 柱缓冲液， 3000r/min 离心 6min ，重复洗涤步骤 3 次。在最后一步洗涤后，确保流量与上样缓冲液量相等，即 100 μ l 。

c.       探针溶液离心之前，放 1.5ml 的反应管在注射器下方的 15ml 管内，与前面步骤相同，加探针液到柱内并离心，过柱后的液体收集在反应管中，这时已含有 20ng/ μ l 的标记探针。该探针已可用于原位杂交或贮存于－ 20 ℃。

 

 

用缺口平移法进行地高辛标记

与缺口平移地生物素化法几乎相同，仅 10 ×寡核苷酸母液成分不同：

0.5mmol/L dATP, 0.5mmol/L dCTP, 0.5 mmol/L dGTP, 0.125 mmol/L 地高辛 -11-dUTP ， 0.375mmol/L dTTP 。

 

 

（三）斑点印迹分析法检测标记物

 

1． 将分装的 1 μ l 标准 DNA 稀释液和同法配制的 1 μ l 待测 DNA 稀释液点于硝酸纤维素膜上。

 

2． 硝酸纤维素膜置 80 ℃真空烤箱内 1h 。

 

3． 室温下，用 AP7.5 缓冲液漂洗硝酸纤维素膜 1min 。

 

4． 将硝酸纤维素膜密封于含 10ml 封闭液的塑料袋中，置 37 ℃温育 30min 。

 

5． 打开塑料袋的一端，弃去封闭液，加入新鲜配制的链亲和素 - 碱性磷酸酶交   联物溶液，重封塑料袋口，置 37 ℃温育 30min 。

 

6． 从塑料袋中取出硝酸纤维膜，用 AP7.5 缓冲液漂洗（室温下两次各 5min ），再用 AP9.5 缓冲液漂洗（室温下 10min ）。

 

7． 将硝酸纤维素膜重封于含显影液的塑料袋中（ 33 μ l NBT 溶于 10ml AP9.5 缓冲液中）。小心混匀后（不可漩涡混匀！）加入 25 μ l BCIP ，再次轻轻混匀反应液，在 37 ℃温育直至显影达满意程度，一般 15 ～ 60min 。

 

8． 从塑料袋中移去硝酸纤维膜，用 TE 缓冲液终止显色反应。

 

9． 空气干燥后，评估分析结果：测试组和对照组 DNA 的颜色密度应进行比较。在理想的杂交结果，最低稀释度信号应当是可见的。

 

 

（四）荧光标记原位杂交探针的混合与变性

 

1． 混合 20 ～ 60ng 单拷贝 DNA 和 3 ～ 5 μ g 经剪切的鲑精 DNA （作为载体）。如果反应后体积少于 10 μ l ，可冻干；若体积较大，可加入 1/20 体积的 3mol/L 乙酸钠和 2 倍体积 100% 乙醇使 DNA 沉淀。混匀并置－ 70 ℃ 30min 。在 4 ℃用 Eppendorf 离心机以 12 000r/min 离心 10min ，弃上清，沉淀物以 500 μ l 70 ％乙醇漂洗后再离心（ 4 ℃， 12 000r/min, 10min ），弃上清并冻干。

2． 重悬于 5 μ l 去离子的甲酰胺中，于室温漩涡混匀数分钟。

3． 加 5 μ l 杂交缓冲液，漩涡混匀 5 ～ 10min 。

4． 在 75 ℃使 DNA 探针变性 5min ，接着冰浴 5min ，这时探针已可用于杂交。

（五）载玻片上 DNA 变性

 

变性

1． 在载玻片上选择合适的杂交区，用铅石笔在载玻片的另一面作记号。

2． 变性前将载玻片置 60 ℃烤箱孵育以防止变性液加至载玻片时温度的降低。

3． 加变性液至 Coplin 广口瓶内，在水浴箱中加热至 70 ℃，用置于瓶内的温度计检测变性液的温度（这是关键步骤！）为得到好的结果，温度应达 70 ℃。

4． 将预热的载玻片（一次不多于 3 片）移至含变性液的 Coplin 广口瓶内准 2min 。

5． 立即将载玻片依次移入含 70 ％、 90 ％和 100 ％乙醇（冰冷）的 Coplin 广口瓶内，各 5min 。

6． 空气干燥后，载玻片已可用于杂交。

 

 

杂交

 

1． 将 10 μ l 含变性探针的杂交混合物加至载玻片的变性靶 DNA 上。

2． 在杂交的液滴上小心地盖上 18 × 18cm 的盖玻片，不要滞留气泡。

3． 用橡皮泥将盖玻片四周封好，置载玻片于湿盒内， 37 ℃温育过夜。

 

 

（六）检测

1． 分别在 42 ℃和 60 ℃的水浴箱内预热漂洗液 A （ 50 ％甲酰胺， 2 × SSC pH7.0 ）和 B （ 1 × SSC ～ 0.1 × SSC pH7.0 ）。

2． 从湿盒内取出载玻片，用镊子小心除去橡皮泥。

3． 置载玻片于含预热至 42 ℃漂洗液 A 的 Coplin 广口瓶中，在水浴箱中振荡 10min 直至盖玻片脱落，将载玻片移至另一含漂洗液 A 的广口瓶中，振荡 5min ，更换漂洗液 A 两次，每次振荡 5min 。

4． 将载玻片移入含预热（ 60 ℃）漂洗液 B 的 Coplin 广口瓶中，漂洗 5min ，更换漂洗液两次，每次漂洗 5min 。

5． 将载玻片从 Coplin 广口瓶中取出，弃尽液体，加 200 μ l 封闭液，盖以 22 × 40mm 的盖玻片，置湿盒内， 37 ℃温育至少 30min 。

6． 从每张载玻片上移去盖玻片，去除过的的液体，加 200 μ l 带荧光的报道分子检测液（如 5 μ g/ml 与荧光素偶联的亲和素或 6 μ g/ml 与罗丹明偶联的抗地高辛抗体），在 37 ℃湿盒内温育 30min 。所有的后序步骤均应在避光的 Coplin 广口瓶中进行（如外裹锡箔纸）。

7． 移去盖玻片，将载玻片移至漂洗液 C （ 4 × SSC ， 0.1 ％ Tween20 pH7.0 ）中，在 42 ℃（振荡水浴箱）漂洗三次各 5min 。

8． 将载玻片置入含复染剂（如 2 × SSC ， 200ng/ml DAPI ）的 Coplin 广口瓶中，室温振荡 20min 。

9． 将载玻片移至漂洗液 D （ 2 × SSC ， 0.05 ％ Tween 20 ）的 Coplin 广口瓶中，室温中温育 1 ～ 2min 。

10．  从 Coplin 广口瓶中取出载玻片，加 20 ～ 30 μ l 防退色液并盖以 22 × 40mm 的盖玻片，置载玻片于合适的盒内，以便 4 ℃长期保存。

 

 

（七）染色体原位抑制（ CISS ）杂交

1． 结合适量标记的探针 DNA ，人竞争 DNA （ Cot1 片段） 2 ～ 4 μ g ，加鲑精 DNA 至总量为 10 μ g DNA 。

2． 加 1/20 体积乙酸钠（ pH5.2 ）和 2 倍体积的乙醇使 DNA 沉淀，置－ 70 ℃ 30min 。 12 000r/min 离心 10 分钟后，大多数可见沉淀。弃上清并用 70 ％乙醇漂洗，再离心弃上清。

3． 冻干样本，重溶于 5 μ l 去离子甲酰胺中。

4． 加 5 μ l 变性缓冲液。

5． 在 75 ℃温育 5min 使 DNA 变性。

6． 迅速将含探针溶液的微量离心管移至 37 ℃，温育 5 ～ 20min （甚至更长）使部分 DNA 再退火。

7． 预退火的探针与变性 DNA 在载玻片上混匀。

8． 继续进行（四，五，六）所述的步骤。

 

 

（八）信号放大

 

1． 小心地从载玻片上移去盖玻片。

2． 将载玻片移至漂洗液 C （ 4 × SSC ， 0.1 ％ Tween20 pH7.0 ）中，在 42 ℃漂洗三次共 10min 。

3． 从 Coplin 广口瓶中取出载玻片，吸去载玻片上的残液，加 200 μ l 含 1 ～ 5 μ g/ml 生物素化的抗亲和素抗体的检测缓冲液，覆以 22 × 40mm 的盖玻片，置湿盒内在 37 ℃温育 30min 。

4． 在 42 ℃含漂洗液 C 的 Coplin 广口瓶中漂洗载玻片三次各 5min 。

5． 从 Coplin 广口瓶中取出载玻片，吸去载玻片上的残液，加 200 μ l 含 5 μ g/ml 偶联荧光染料的亲和素检测缓冲液。

6． 漂洗和染色体步骤见（六）。

 

 

（九）多色荧光标记原位杂交

1． 在 DNA 沉淀之前，采用几种与不同报道分子结合的探针，而不是仅用一种探针。

2． 合适的报道分子结合物必须加到检测缓冲液中（六）。每种报道分子结合物应与一种荧光染料结合，该染料在光谱上能与同一实验所用的其它荧光染料相区别。