杂交瘤细胞的制备

1. 骨髓瘤细胞的准备

选择生长状态良好的细胞，浑圆透亮，大小均一，边缘清晰，排列整齐，呈半致密分布。弃上清，以不完全培养基洗涤一次后，用10mL不完全培养基将骨髓瘤细胞（SP2/0）轻轻吹下。

2. 脾淋巴细胞的准备

a、取加强免疫后3天的小鼠，摘除眼球采血供分离阳性血清。

b、颈脱位将小鼠致死，用75%酒精消毒体表5min，随即放入超净台内小鼠解剖板上，左侧卧位，用7号针头固定四肢。

c、无菌打开腹腔取出脾脏，用基础培养基洗涤，并仔细去掉周围附着的结缔组织。

d、随后将脾脏转移到另一个盛有DMEM的平皿中。以弯头针头压住脾脏，用小针头在脾脏上插孔，并用镊子挤压，使脾细胞充分释放，制成脾细胞悬液。

3. 饲养细胞的制备

取一只健康的ICR小鼠，摘眼球采血，颈脱臼处死，体表消毒和固定后，从大腿上剪开皮肤，暴露腹膜，酒精棉球消毒腹膜。用10mL注射器，12#针头，注射5-10mL HAT培养基到腹腔，右手固定注射器，左手持酒精棉球轻轻按摩腹部，抽回腹腔内液体，注入已准备好的容器中。

4. 细胞融合

a、将上述制备的骨髓瘤细胞与脾细胞混合于一支50mL的带盖的离心管中，1000rpm离心10min，上清要充分吸净，以免影响PEG的作用。

b、将融合管置于手掌中，轻轻振荡底部，务使两种细胞充分混匀。

c、用1mL吸管将预热的PEG在45~60s内缓慢加到融合管中，边加边轻轻摇匀。

d、立即滴加37℃预热的DMEM，使PEG稀释而失去作用，具体加法是用吸管在第一分钟内加1mL预热的不完全培养基，第二分钟内加2mL，第三分钟加8mL（遵照先慢后快的原则），37℃静置10min，1000rpm离心10min，弃上清。

e、加入5mL的HAT培养基，轻轻悬浮沉淀细胞，再加入适量的腹腔巨噬细胞，最后补加HAT至50mL左右。

f、分装于96孔细胞培养板，然后将培养板置37℃，5%CO2培养箱内培养。

g、5d后用HAT培养基换出一半培养基。

h、观察杂交瘤细胞的生长情况，待其细胞培养上清变黄或克隆分布至孔底面积的1/10以上时，吸取适量细胞上清进行抗体检测。